Isolasi DNA
Komponen utama kromosom pada eukoariota adalah DNA dan protein histon. Protein histon ini bersifat basa, sehingga dapat menetralkan sifat asam dari DNA. Pada dasarnya sel mengandung dua asam nukleat yaitu RNA dan DNA. DNA yang terdapat di nukleus disebut DNA kromosomal, sedangkan DNA lain yang terdapat di dalam sel dan diluar nukleus yaitu DNA mitokondria, DNA kloroplas, dan DNA plasmid, ketiganya disebut DNA ekstrakromosomal.
Isolasi DNA merupakan tahap pertama dari berbagai teknologi analisis DNA. DNA dapat ditemukan baik pada kromosom inti maupun organel, yaitu pada mitokondria dan kloroplas. Untuk mengekstrak DNA diperlukan langkah-langkah laboratorium untuk memecahkan dinding sel dan membran inti, yang dilanjutkan dengan pemisahan DNA dari berbagai komponen sel yang lain. Pada saat melakukannya, DNA harus dijaga agar tidak rusak dan didapatkan DNA dalam bentuk rantai panjang.
Faktor-Faktor Yang Mempengaruhi Ekstraksi DNA
Proses pengeluaran DNA dari nukleus, mitokondria maupun organel lain - dengan cara diekstraksi atau dilisiskan - biasanya dilakukan dengan homogenasi dengan penambahan bufer ekstraksi atau bufer lisis untuk mencegah DNA rusak. Pada kondisi sampel tertentu, untuk membantu lisis dari membran sel, maka sampel daun dimasukkan dulu ke nitrogen cair dan langsung digerus sebelum ditambahkan bufer ekstraksi. Senyawa yang biasa digunakan untuk memaksimalkan hasil isolat DNA yang murni ditambahkan fenol, kloroform, daun isoamil alkohol.
Proses selanjutnya adalah pemisahan DNA dari komponen sel yang lain atau kontaminan yang tidak diinginkan. Pemisahan DNA dari komponen sel DNA dari komponen sel lain, termasuk debris sel, dilakukan dengan sentrifugasi.
Kontaminan yang umum ditemukan diantaranya adalah polisakarida yang dapat mengganggu proses lanjutan seperti PCR, dimana terjadi hambatan aktivitas Taq polimerase, atau kontaminan lainnyayaitu polifenol yang dalam bentuk teroksidasi akan mengikat DNA secara kovalen. Untuk menghindari terjadinya hal ini, maka jaringan yang digunakan dijaga tetap dingin sebelumdan selama proses ekstraksi.
Setelah dilakukan ekstraksi, maka proses dilanjutkan dengan presipitasi DNA dengan menggunakan etanol absolut atai isopropanol. Selain DNA, semua bahan yang lain akan larut dalam etanol dingin. Dengan demikian, saat dilakukan sentrifugasi, maka DNA akan mengendap dan terpisah dari senyawa-senyawa atau bahan lain. Pada sampel darah, presipitasi dilakukan dengan salting-out yaitu supernatan dipisahkan dari protein atau debris sel dengan pemberian larutan garam berkonsentrasi tinggi. Biasanya akan diperoleh supernatan DNA yang kental pada saat dimasukkan ke etanol absolut. Bila hal ini terjadi, siapkan tabung yang berisi 70%-etanol, dan segera ambil DNA tadi dengan mikropipet 1000 ul, dan pindahkan ke tabung yang berisi 70%-etanol.
Sebagia bahan dasar untuk analisis lanjutan seperti PCR, RFLP, kloning atau sekuensing, maka DNA yang digunakan harus bersih dari kontaminan (mempunyai kemurnian tinggi) dan memiliki berat molekul yang tinggi. Selama proses ekstraksi DNA, beberapa hal yang dapat terjadi, antara lain :
- DNA patah-patah selama proses isolasi.
- DNA terdegradasi oleh enzim nuklease.
- Terjadi kontaminasi oleh polisakarida.
- Metabolit sekunder ikut terisolasi.
Denaturasi dan Renaturasi DNA
Proses denaturasi dan renaturasi molekul DNA tergantung pada banyak faktor, antara lain :
- Suhu. Suhu leleh (melting temperature, Tm) yang tinggi menyebabkan untai ganda DNA akan terurai menjadi untai tunggal, tetapi bila suhu ini diturunkan secara perlahan, maka akan terjadi renaturasi menjadi untai heliks ganda DNA seperti semula.
- Derajat keasaman (pH) yang ekstrem (pH<3 atau pH>10) dapat menyebabkan DNA terdenaturasi.
- Konsentrasi isoelektrolit seperti Na+ dan K pada larutan ekstraksi yang digunakan.
- Perbandingan kandungan antara basa nukleotida GC terhadap AT. Tingginya kandungan GC akan memperlambat proses denaturasi molekul DNA. Sebaliknya, kandungan AT yang tinggi akan menyebabkan pita DNA mudah putus/patah.
Sumber : Fatchiah, dkk. 2011. Biologi Molekuler. Erlangga : Jakarta
Post a Comment