Panduan Lengkap Resusitasi Stok Biakan dari -70°C: Protokol untuk Bakteri dan Jamur

Table of Contents

 

INFOLABMED.COM - Penyimpanan stok biakan pada suhu ultra-rendah (-70°C atau -80°C) adalah metode preservasi jangka panjang yang ideal. 

Namun, keberhasilan menjaga viabilitas isolat bergantung pada teknik resusitasi stok biakan dari -70°C yang benar. 

Baca Juga: Mikrobiologi : Pengaruh Lingkungan Terhadap Pertumbuhan Mikroba

Kesalahan dalam proses pencairan (thawing) dapat menyebabkan cold shock, kematian sel, dan kegagalan menumbuhkan kembali kultur.

Prinsip Dasar Resusitasi yang Berhasil

Tujuan resusitasi adalah mengembalikan sel mikroba dari keadaan metabolik terhenti (dormant) ke keadaan aktif tumbuh, dengan meminimalkan stres seluler. 

Kunci utamanya adalah kecepatan dan suhu yang tepat.

Alat dan Bahan yang Diperlukan

1. Stok Biakan: Cryovial yang berisi kultur dalam media preservasi (seperti Brain Heart Infusion Broth dengan 15-20% gliserol atau Skim Milk).
2. Penangas Air (Water Bath): Disetel pada suhu 35-37°C untuk bakteri atau 25-30°C untuk jamur/kapang.
3. Media Pertumbuhan: Media cair (broth) atau padat (agar) yang sesuai dan telah dipersiapkan sebelumnya.
4. ​​Alat Pipet Steril dan Tips.
5. Bunsen Burner atau Biological Safety Cabinet (BSC) untuk bekerja aseptik.
6. Incubator dengan suhu yang sesuai.

Protokol Langkah Demi Langkah Resusitasi

Langkah 1: Persiapan

• Siapkan semua alat dan media di dekat area kerja.
• Nyalakan penangas air dan pastikan suhunya stabil.
• Labeli media yang akan diinokulasi dengan detail isolat dan tanggal.

Langkah 2: Pencairan Cepat (Rapid Thawing)

• PENTING: Keluarkan cryovial dari freezer -70°C dan segera masukkan ke dalam penangas air yang telah disetel suhunya.
• Kocok cryovial dengan lembut di dalam penangas air hingga isinya hampir seluruhnya cair (sekitar 80-90%). Proses ini biasanya memakan waktu 1-2 menit.
• Jangan biarkan cryovial terlalu lama di penangas air setelah cair total untuk menghindari suhu yang terlalu tinggi bagi sel.

Langkah 3: Inokulasi Aseptik

• Segera angkat cryovial dari penangas air, lap bagian luarnya dengan disinfektan (alkohol 70%).
• Buka tutup cryovial di dekat api Bunsen atau di dalam BSC.
• Dengan pipet steril, pindahkan sejumlah kecil isi cryovial (misalnya 50-100 µL) ke dalam media cair, atau goreskan di atas media padat.
• Untuk hasil terbaik, kultur dapat dipindahkan ke dua media: satu media cair untuk pertumbuhan cepat dan satu media padat untuk kemurnian.

Langkah 4: Inkubasi dan Pemantauan

• Segera masukkan media yang telah diinokulasi ke dalam inkubator pada suhu yang sesuai.
• Media cair dapat diinkubasi dalam shaker incubator untuk aerasi lebih baik.
• Pantau pertumbuhan setiap 24 jam.

Langkah 5: Subkultur (Jika Diperlukan)

• Setelah pertumbuhan terlihat di media cair atau koloni tumbuh di media padat, lakukan subkultur untuk mendapatkan kultur segar yang siap digunakan dalam pemeriksaan.

Tips dan Pemecahan Masalah

1. Kegagalan Tumbuh: Kemungkinan karena cold shock akibat thawing terlalu lama di suhu kamar, media preservasi tidak cocok, atau viabilitas stok sudah menurun. Ulangi resusitasi dengan cryovial cadangan dan pastikan kecepatan thawing.
2. Kontaminasi: Pastikan bekerja secara aseptik. Jika terjadi, buang kultur dan gunakan stok baru.
3. Pertumbuhan Lambat: Beberapa bakteri (misalnya, Mycobacterium spp.) secara alami tumbuh lambat. Bersabarlah dan gunakan media yang diperkaya khusus.
4. Regenerasi Stok Baru: Selalu buat stok beku baru dari kultur hasil resusitasi yang berhasil untuk menjaga koleksi kultur Anda.

Resusitasi stok biakan dari -70°C adalah keterampilan dasar laboratorium mikrobiologi yang memerlukan presisi. 

Baca Juga: Cara Pembuatan Biakan Jaringan Cara Perfusi

Kunci keberhasilan terletak pada pencairan yang cepat dan penanganan aseptik segera setelahnya. 

Protokol yang tepat tidak hanya mengembalikan kehidupan kultur tetapi juga menjaga karakteristik asli dan viabilitas mikroba untuk mendukung berbagai tes diagnostik dan penelitian.

---

Dapatkan informasi terbaru seputar teknik laboratorium dengan mengikuti media sosial Infolabmed.com. Ikuti update kami di Telegram, Facebook, dan Twitter/X. Dukung kami menyediakan konten edukasi berkualitas dengan memberikan donasi via DANA di sini.

---