Serial Dilution: A Fundamental Technique in Quantitative Microbiology – Cara Menghitung CFU/mL Sampel

Table of Contents

INFOLABMED.COM - Serial dilution: a fundamental technique in quantitative microbiology yang digunakan untuk mengurangi konsentrasi mikroorganisme dalam sampel secara bertahap (logaritmik), sehingga koloni bakteri dapat dihitung pada media padat (total plate count). Teknik ini paling sering diterapkan untuk:

• Hitung angka lempeng total (ALT) – untuk menentukan jumlah bakteri dalam sampel (air, makanan, urin, swab lingkungan).
• Uji resistensi antibiotik (MIC – Minimum Inhibitory Concentration) – untuk menentukan konsentrasi antibiotik terendah yang menghambat pertumbuhan bakteri.
• Titrasi virus (TCID50, plaque assay).
• Pembuatan kurva standar (CFU/mL vs OD).

Artikel ini akan memandu Anda melakukan serial dilution 10x (pengenceran kelipatan 10) yang paling umum di laboratorium mikrobiologi, menghitung CFU/mL, dan menginterpretasi hasil sesuai standar.

Prinsip Serial Dilution

Prinsip dasar serial dilution adalah mengambil 1 mL dari sampel (atau pengenceran sebelumnya) dan mencampurkannya dengan 9 mL cairan pengencer (misal saline steril, buffer peptone water), menghasilkan pengenceran 1:10 (10⁻¹). Proses diulang 2-3-4-5 kali untuk mendapatkan pengenceran 10⁻², 10⁻³, 10⁻⁴, dst.

Tingkat Pengenceran	Rasio	Faktor Pengenceran
10⁻¹	1:10	10
10⁻²	1:100	100
10⁻³	1:1.000	1.000
10⁻⁴	1:10.000	10.000
10⁻⁵	1:100.000	100.000
10⁻⁶	1:1.000.000	1.000.000

Setelah pengenceran, 0.1 mL (100 µL) dari setiap tingkat pengenceran (biasanya 3-4 tingkat terakhir) diinokulasikan ke media agar (NA, PCA, atau agar selektif), diinkubasi, lalu koloni dihitung. Hasil dinyatakan sebagai CFU/mL (colony forming units per milliliter).

Alat dan Bahan Serial Dilution

Alat / Bahan	Spesifikasi	Keterangan
Tabung reaksi / botol pengencer	Volume 15-20 mL, tutup ulir	Berisi 9 mL saline steril (0.9% NaCl) atau buffer peptone water
Pipet mikropipet (P1000 dan P200)	100-1000 µL dan 20-200 µL	Harus steril (tip sekali pakai)
Vortex mixer	Untuk mencampur larutan	Pastikan homogen setiap tingkat
Media agar	Nutrient Agar (NA), Plate Count Agar (PCA), atau selektif	Tuang ke cawan petri (20-25 mL)
Spread glass (spreader) steril	Batang L (L-rod) dari kaca	Untuk meratakan inokulum di permukaan agar
Sampel	Urine, air, swab makanan, suspensi bakteri	Diencerkan terlebih dahulu jika terlalu pekat (curiga >300 CFU/mL)

Prosedur Serial Dilution (Pengenceran 10x)

Langkah 1: Persiapan

1. Siapkan tabung pengencer berisi 9 mL saline steril, beri label: 10⁻¹, 10⁻², 10⁻³, 10⁻⁴, 10⁻⁵ (sesuai kebutuhan).
2. Siapkan media agar di cawan petri (minimal 3 cawan per tingkat pengenceran, untuk triplo).

Langkah 2: Membuat Pengenceran Pertama (10⁻¹)

• Homogenkan sampel asli (vortex).
• Pipet 1 mL sampel ke tabung 10⁻¹ (berisi 9 mL saline). Vortex. Sekarang tabung 10⁻¹ memiliki konsentrasi = pengenceran 10x (10⁻¹).

Langkah 3: Membuat Pengenceran Kedua (10⁻²)

• Pipet 1 mL dari tabung 10⁻¹, pindahkan ke tabung 10⁻² (berisi 9 mL saline). Vortex. Pengenceran total = 10⁻¹ × 10⁻¹ = 10⁻².

Langkah 4: Ulangi untuk Pengenceran Selanjutnya

• Lanjutkan hingga tingkat yang diinginkan (biasanya hingga 10⁻⁶ jika sampel diperkirakan sangat pekat, seperti kultur bakteri murni).

Langkah 5: Inokulasi ke Cawan Petri

• Untuk setiap tingkat pengenceran (misal 10⁻⁴, 10⁻⁵, 10⁻⁶), pipet 0.1 mL (100 µL) dari tabung, teteskan di permukaan media agar (jangan dioles).
• Gunakan spreader steril (L-rod) untuk meratakan tetesan ke seluruh permukaan agar (teknik spread plate). Lakukan untuk 2-3 cawan per tingkat pengenceran (duplo atau triplo).
• Alternatif: teknik pour plate (campur 1 mL sampel + media agar cair suhu 45°C), tetapi spread plate lebih umum untuk serial dilution.

Langkah 6: Inkubasi

• Inkubasi cawan pada 35-37°C selama 24-48 jam (tergantung bakteri). Media selektif mungkin perlu 48 jam.

Langkah 7: Hitung Koloni

• Pilih cawan dengan jumlah koloni antara 30-300 koloni (ideal). Jika <30 CFU, terlalu sedikit (kurang akurat). Jika >300 CFU, terlalu padat (count tidak akurat – overlapping).
• Hitung jumlah koloni di setiap cawan (gunakan colony counter jika perlu).

Langkah 8: Hitung CFU/mL menggunakan Rumus

Rumus:

CFU/mL = Jumlah koloni / (Volume inokulum × Faktor pengenceran)

Contoh:

• Cawan dengan pengenceran 10⁻⁵, volume inokulum 0.1 mL, didapat 120 koloni.
• Faktor pengenceran = 10⁵ (kebalikan dari 10⁻⁵) = 100.000.
• Volume inokulum dalam mL = 0.1.
• CFU/mL = 120 / (0.1 × 10⁵) = 120 / (0.1 × 100.000) = 120 / 10.000 = 1.2 × 10⁷ CFU/mL.

Rumus praktis untuk inokulum 0.1 mL (100 µL):

CFU/mL = Jumlah koloni × Faktor pengenceran × 10

Dari contoh: 120 × 10⁵ × 10 = 120 × 10⁶ = 1.2 × 10⁸? TIDAK! hitung ulang: 120 × 10⁵ × 10 = 120 × 10⁶ = 1.2 × 10⁸ CFU/mL. Namun sebelumnya kita dapat 1.2 × 10⁷ – ada kesalahan. Mari kita hitung dengan teliti:

Rumus yang benar: CFU/mL = (Jumlah koloni × Faktor pengenceran) / Volume inokulum (dalam mL)

Jadi: (120 × 10⁵) / 0.1 = (120 × 100.000) / 0.1 = 12.000.000 / 0.1 = 120.000.000 = 1.2 × 10⁸ CFU/mL. (Karena 1/0.1 = 10, maka rumus = koloni × faktor pengenceran × 10).

Nah, jika volume inokulum = 0.1 mL, maka rumus = CFU/mL = (koloni × Faktor pengenceran) × 10. Faktor pengenceran = 10⁵ (10 pangkat 5), koloni=120, maka CFU = 120 × 100.000 × 10 = 120 × 1.000.000 = 120.000.000 = 1.2 × 10⁸ CFU/mL.

Sekali lagi, selalu gunakan rumus (koloni × Faktor pengenceran) / (volume inokulum dalam mL).

Contoh tabel hasil hitung (volume inokulum 0.1 mL):

Pengenceran	Faktor Pengenceran (kebalikan)	Jumlah Koloni (rata-rata duplo)	CFU/mL (koloni × Faktor / 0.1)	Interpretasi
10⁻⁴	10⁴ (10.000)	>300 (TBUD)	–	Terlalu banyak (pilih pengenceran lebih tinggi)
10⁻⁵	10⁵ (100.000)	120	120 × 100.000 / 0.1 = 1.2 × 10⁸	Baik (30-300)
10⁻⁶	10⁶ (1.000.000)	12	12 × 1.000.000 / 0.1 = 1.2 × 10⁸	<30 (kurang akurat, tetapi hitung tetap)

Contoh Perhitungan Lengkap

Kasus: Uji total plate count (TPC) sampel air sumur. Dilakukan serial dilution hingga 10⁻⁵, inokulum 0.1 mL ke NA, inkubasi 48 jam. Hasil:

Pengenceran	Koloni di cawan 1	Koloni di cawan 2	Rata-rata
10⁻³	>300	>300	TBUD
10⁻⁴	220	230	225
10⁻⁵	25	28	26,5 (dibulatkan 27)

Hitung CFU/mL untuk pengenceran 10⁻⁴ (225 koloni): CFU = 225 × 10⁴ / 0.1 = 225 × 10.000 / 0.1 = 2.250.000 / 0.1 = 22.500.000 CFU/mL (2.25 × 10⁷ CFU/mL).

Hitung CFU/mL untuk pengenceran 10⁻⁵ (27 koloni): CFU = 27 × 10⁵ / 0.1 = 27 × 100.000 / 0.1 = 2.700.000 / 0.1 = 27.000.000 CFU/mL (2.7 × 10⁷ CFU/mL).

Kedua nilai cukup dekat (2.25 × 10⁷ vs 2.7 × 10⁷). Laporkan rata-rata dari kedua pengenceran yang valid (jika dalam rentang 30-300 koloni) – dalam hal ini yang dalam rentang adalah 10⁻⁴ (225) dan 10⁻⁵ berada di bawah 30, jadi sebaiknya laporan hanya menggunakan pengenceran 10⁻⁴.

Hasil akhir: 2.25 × 10⁷ CFU/mL.

Kesalahan Umum dalam Serial Dilution

Kesalahan	Akibat	Solusi
Tidak memvortex tabung setiap tingkat	Sel bakteri mengendap, CFU/mL tidak representatif	Vortex 5-10 detik sebelum mengambil sampel untuk tingkat berikutnya.
Pipet 1 mL tidak akurat (menggunakan pipet yang tidak kalibrasi)	Faktor pengenceran tidak tepat	Kalibrasi pipet secara rutin. Gunakan pipet dengan tip steril.
Kontaminasi silang antar pengenceran (menggunakan pipet yang sama tanpa ganti tip)	Peningkatan jumlah koloni di pengenceran tinggi secara palsu	Ganti tip setiap kali pindah ke tingkat pengenceran berbeda.
Volume inokulum tidak 0.1 mL (lebih banyak atau kurang)	CFU/mL menjadi tidak akurat	Kalibrasi pipet; pastikan volume tepat.
Koloni dihitung sebelum masa inkubasi optimal	CFU/mL underestimasi	Inkubasi sesuai jenis mikroba (24-48 jam untuk bakteri, 3-7 hari untuk jamur).
Memilih cawan dengan koloni >300 (TBUD)	Tidak dapat dihitung	Lakukan pengenceran lebih tinggi (10⁻⁶, 10⁻⁷) pada pengulangan.

Serial Dilution untuk MIC (Minimum Inhibitory Concentration)

Dalam uji MIC (misal menggunakan microdilution broth di plate 96-well), prinsipnya sama tetapi menggunakan pengenceran basis 2 (serial dilution 1:2). Contoh:

Konsentrasi Antibiotik (µg/mL)	Log2 dilution
128	2⁷
64	2⁶
32	2⁵
16	2⁴
8	2³
4	2²
2	2¹
1	2⁰

Proses: campur 100 µL antibiotik konsentrasi tinggi dengan 100 µL media (1:2), lanjutkan ke well berikutnya.

Kesimpulan

Serial dilution: a fundamental technique in quantitative microbiology yang harus dikuasai setiap ATLM di laboratorium mikrobiologi. Serial dilution 10x (pengenceran kelipatan 10) digunakan untuk menghitung CFU/mL dari sampel (air, makanan, swab lingkungan, urin, dahak). Prinsipnya: 1 mL sampel (atau pengenceran sebelumnya) + 9 mL saline steril → pengenceran 10⁻¹. Lanjutkan hingga 10⁻⁶ atau lebih. Inokulasi 0.1 mL ke media agar (spread plate), hitung koloni pada cawan dengan jumlah 30-300, lalu hitung CFU/mL dengan rumus:

CFU/mL = (Jumlah koloni × Faktor pengenceran) / Volume inokulum (mL)

Dengan volume inokulum 0.1 mL, rumus menjadi CFU/mL = Jumlah koloni × Faktor pengenceran × 10.

Serial dilution juga penting untuk uji MIC (pengenceran 2x), titrasi virus, dan pembuatan kurva standar. Kesalahan teknis (tidak vortex, kontaminasi silang, pipet tidak akurat) dapat menghasilkan hasil yang tidak valid. Kuasai teknik ini karena menjadi dasar dari setiap pekerjaan mikrobiologi kuantitatif.

Follow Media Sosial Infolabmed.com melalui chanel Telegram [Link : https://t.me/infolabmedcom], Facebook [Link : https://www.facebook.com/infolabmed/], Twitter/X [Link : https://x.com/infolabmed]. Berikan DONASI terbaikmu untuk perkembangan website infolabmed.com melalui Donasi via DANA https://link.dana.id/minta?full_url=https://qr.dana.id/v1/281012012020092524655592.