Biofilm Test: Metode Deteksi Kemampuan Bakteri Membentuk Biofilm di Laboratorium Mikrobiologi

Table of Contents

 

INFOLABMED.COM - Biofilm adalah komunitas mikroorganisme (bakteri, jamur) yang melekat pada permukaan biotik (jaringan tubuh) atau abiotik (kateter, implan, pipa) dan terbungkus dalam matriks polimer ekstraseluler (EPS) yang terdiri dari polisakarida, protein, dan DNA. Kemampuan membentuk biofilm adalah salah satu faktor virulensi terpenting pada bakteri seperti Staphylococcus aureus (khususnya MRSA), Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, dan Candida albicans. Bakteri dalam biofilm resisten terhadap antibiotik hingga 100-1000 kali lipat dibandingkan bakteri planktonik (bentuk bebas), sehingga infeksi terkait biofilm (misal pada kateter intravena, ventilator-associated pneumonia, endokarditis, cystic fibrosis) sulit diobati dan cenderung kambuh.

Artikel ini akan membahas biofilm test – metode sederhana, murah, dan semi-kuantitatif menggunakan mikrotiter plate dengan pewarnaan kristal violet – untuk menilai kemampuan isolat klinis membentuk biofilm di laboratorium.

Mengapa Biofilm Test Penting?

Identifikasi kemampuan biofilm pada isolat klinis memiliki implikasi langsung pada tata laksana pasien:

Parameter	Tanpa Biofilm	Dengan Biofilm
Respon terhadap antibiotik	Baik (bakteri planktonik sensitif)	Buruk (bakteri dalam biofilm resisten – membutuhkan dosis lebih tinggi atau terapi kombinasi)
Durasi terapi	Singkat (5-7 hari)	Panjang (2-6 minggu)
Kebutuhan pengangkatan benda asing	Tidak perlu	Sering perlu (misal melepas kateter, mengganti implan)
Risiko kekambuhan	Rendah	Tinggi (infeksi persisten)
Pilihan antibiotik	Antibiotik biasa (sesuai AST)	Antibiotik penetrasi biofilm: rifampisin + (fosfomisin atau sefazolin) untuk stafilokokus; kolistin atau aerosol tobramisin untuk P. aeruginosa

Dengan melakukan biofilm test, laboratorium dapat memberikan informasi tambahan kepada klinisi bahwa isolat tersebut bersifat "persistent" dan memerlukan strategi terapi yang lebih agresif.

Prinsip Biofilm Test (Metode Mikrotiter Plate – Kristal Violet)

Metode ini pertama kali diperkenalkan oleh Christensen et al. (1985) dan hingga kini menjadi gold standard untuk skrining kemampuan pembentukan biofilm karena mudah, murah, dan dapat diukur secara semi-kuantitatif.

Prinsip: Bakteri diinkubasi dalam well (lubang) mikrotiter plate yang berisi media cair (TSB + glukosa). Bakteri yang mampu membentuk biofilm akan melekat pada dasar well (plastik polistiren). Setelah inkubasi, planktonik bacteria (tidak melekat) dicuci, lalu biofilm yang terikat diwarnai dengan kristal violet (pewarna yang mengikat sel dan matriks EPS). Kristal violet kemudian dilarutkan dengan etanol atau asam asetat, dan absorbansi dibaca dengan spektrofotometer (ELISA reader) pada panjang gelombang 570-595 nm. Semakin tinggi absorbansi, semakin tebal biofilm yang terbentuk.

Kelebihan: Dapat menilai biofilm secara kuantitatif (bandingkan dengan kontrol negatif, kategorikan: non-adherent, weak, moderate, strong biofilm producer).

Alat dan Bahan

Alat / Bahan	Spesifikasi	Keterangan
Mikrotiter plate	96-well, flat bottom (polystyrene, non-treated)	Jangan gunakan "tissue culture treated" (sudah dimodifikasi untuk sel eukariotik)
Media kultur	TSB (Tryptic Soy Broth) + 0.25-1% glukosa	Glukosa merangsang produksi biofilm
Isolat bakteri	Suspensi setara 0.5 McFarland (~1.5×10^8 CFU/mL) dalam TSB	Encerkan 1:100 (jadi 10^6 CFU/mL)
Kontrol positif	Staphylococcus epidermidis ATCC 35984 (biofilm kuat)	Pastikan tersedia
Kontrol negatif	Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 (tidak membentuk biofilm)	Atau well tanpa bakteri (TSB saja)
Pewarna	Kristal violet 0.1-1% (dalam akuades)	Saring dengan kertas saring 0.22 µm sebelum digunakan
Fiksatif	Metanol 95-100% (atau 2.5% glutaraldehyde, opsional)	Untuk memfiksasi biofilm sebelum pewarnaan
Pelarut	Asam asetat 33% atau etanol 95%	Melarutkan kristal violet yang terikat
Spektrofotometer	ELISA reader (panjang gelombang 570 nm)	Atau spektrofotometer biasa dengan kuvet
Pipet multichannel	8 atau 12-channel, volume 50-200 µL	Mempercepat pengisian well

Prosedur Biofilm Test (Langkah demi Langkah)

Hari 1 – Inokulasi dan Inkubasi

Langkah	Deskripsi
1. Persiapan suspensi bakteri	Ambil 3-5 koloni segar dari agar (18-24 jam). Suspensikan dalam TSB hingga setara 0.5 McFarland. Encerkan 1:100 dengan TSB (+ 0.25% glukosa) untuk mendapatkan ~10^6 CFU/mL.
2. Isi mikrotiter plate	Pipet 200 µL suspensi ke setiap well. Lakukan triplo (3 well untuk setiap isolat). Untuk kontrol negatif: isi dengan TSB steril (tanpa bakteri). Untuk kontrol positif: isi dengan S. epidermidis ATCC 35984.
3. Inkubasi	Tutup plate (bisa dengan parafilm atau tutup plate), inkubasi 24 jam pada 35-37°C tanpa guncangan (statis). Jangan di-shaker!
4. Kontrol kontaminasi	Periksa well secara visual setelah 24 jam. Jika well keruh → ada pertumbuhan bakteri.

Hari 2 – Pencucian, Pewarnaan, dan Pembacaan

Langkah	Deskripsi
5. Buang planktonik bacteria	Balikkan plate di atas wastafel (atau wadah berisi desinfektan), buang isi well. Ketuk plate dengan lembut di atas kertas tisu untuk mengeluarkan sisa cairan.
6. Pencucian (washing)	Tambahkan 200 µL PBS (phosphate buffered saline) atau akuades steril ke setiap well. Buang, ketuk plate. Ulangi 3-5x untuk membersihkan bakteri yang tidak melekat.
7. Fiksasi (opsional)	Tambahkan 200 µL metanol ke setiap well, diamkan 15 menit. Buang, biarkan kering (agar biofilm "terpaku" di dasar plate). Langkah ini dapat dihilangkan jika pewarnaan langsung setelah pencucian (tetapi fiksasi memberikan hasil yang lebih konsisten).
8. Pewarnaan dengan kristal violet	Tambahkan 200 µL larutan kristal violet 0.1% ke setiap well. Inkubasi pada suhu ruang selama 15-30 menit.
9. Cuci kelebihan pewarna	Buang kristal violet, cuci dengan akuades mengalir (atau dengan merendam plate dalam wadah berisi akuades, ganti air 3x) hingga air cucian jernih. Keringkan plate di suhu ruang (boleh dibalik di atas kertas tisu).
10. Melarutkan kristal violet	Tambahkan 200 µL asam asetat 33% (atau etanol 95%) ke setiap well. Inkubasi 10-15 menit, goyang plate perlahan untuk melarutkan semua warna.
11. Pembacaan absorbansi	Pindahkan 150 µL larutan dari setiap well ke plate baru (atau baca langsung di ELISA reader). Baca absorbansi pada 570 nm (untuk kristal violet; bisa juga 595 nm). Gunakan well kontrol negatif (TSB tanpa bakteri) sebagai blank.

Interpretasi Hasil (Kategorisasi Biofilm)

Hitung OD (optical density) rata-rata dari 3 well untuk setiap isolat. Bandingkan dengan cut-off (ODc) = OD rata-rata kontrol negatif + (3 × standar deviasi kontrol negatif).

Kategori	OD (dibanding ODc)	Interpretasi Klinis
Non-biofilm producer	OD ≤ ODc	Bakteri tidak membentuk biofilm; infeksi kemungkinan akut, responsif terhadap antibiotik biasa.
Weak biofilm producer	ODc < OD ≤ (2 × ODc)	Membentuk biofilm lemah; infeksi mungkin dapat diatasi dengan antibiotik dosis tinggi.
Moderate biofilm producer	(2 × ODc) < OD ≤ (4 × ODc)	Biofilm sedang; infeksi kronis, membutuhkan antibiotik penetrasi biofilm.
Strong biofilm producer	OD > (4 × ODc)	Biofilm kuat; sangat resisten, hampir pasti memerlukan pengangkatan benda asing/kateter.

Contoh: Kontrol negatif ODc = 0.100. Maka:

• OD ≤ 0.100 → non-biofilm producer.
• OD 0.101-0.200 → weak.
• OD 0.201-0.400 → moderate.
• OD > 0.400 → strong.

Tabel Contoh Hasil Biofilm Test (Isolat Klinis)

Isolat	Spesies	OD570 (rata-rata)	Kategori	Implikasi
Kontrol negatif (steril)	–	0.09	–	Cut-off (ODc) = 0.09 + (3×0.01)=0.12
Kontrol positif	S. epidermidis ATCC 35984	0.85	Strong	Validasi uji OK
Isolat A	S. aureus MRSA	0.52	Strong	Pasien dengan infeksi kateter: harus lepas kateter + beri rifampisin + sefazolin
Isolat B	P. aeruginosa (CF)	0.38	Moderate	Pasien cystic fibrosis: perlu aerosol tobramisin + oral azitromisin
Isolat C	E. coli (ISK kateter)	0.11	Non	Infeksi akut, mungkin responsif terhadap kotrimoksazol/siprofloksasin
Isolat D	K. pneumoniae	0.15	Weak	Monitor klinis; jika tidak respons dalam 72 jam, curiga biofilm

Variasi Metode Biofilm Test Lainnya

Selain mikrotiter plate-kristal violet, ada beberapa metode lain untuk menilai biofilm:

Metode	Prinsip	Kelebihan	Kekurangan	Kapan menggunakan
Tube method (Christensen)	Kultur bakteri dalam tabung polistiren, buang cairan, warnai dengan kristal violet, amati warna yang menempel di dinding tabung secara visual	Sangat sederhana, tanpa spektrofotometer	Kualitatif (hanya + atau -), sensitivitas rendah	Laboratorium tanpa ELISA reader (skrining kasar)
Congo Red Agar (CRA)	Bakteri ditanam di agar yang mengandung Congo red dan sukrosa; koloni penghasil biofilm berwarna hitam; non-biofilm merah	Sederhana, langsung di plate agar, murah	Sulit dibedakan warna (interpretasi subjektif), false positive rate tinggi	Skrining awal untuk stafilokokus
Calgary Biofilm Device	96 pin pegs yang dapat dipindahkan ke plate berisi antibiotik serial dilusi	Dapat menentukan MIC untuk biofilm (MBEC – Minimum Biofilm Eradication Concentration)	Perlu alat khusus, mahal	Penelitian (tidak rutin klinis)
Microscopy (SEM, CLSM)	Mikroskop elektron atau confocal untuk melihat struktur biofilm 3D	Akurat, informatif (morfologi)	Mahal, tidak praktis untuk klinis	Penelitian

Interpretasi Klinis: Apa yang Dilaporkan ke Dokter?

Laboratorium harus melaporkan tidak hanya "positif biofilm" tetapi juga kekuatan pembentukan biofilm dan rekomendasi terapi.

Contoh laporan:

Hasil Biofilm Test (Metode Mikrotiter Plate – Kristal Violet)

Isolat: Staphylococcus aureus (MRSA)

OD570: 0.62 (Cut-off 0.12)

Kategori: Strong biofilm producer

Interpretasi: Bakteri ini membentuk biofilm kuat. Infeksi yang terkait dengan benda asing (kateter, implan) kemungkinan akan persisten dan resisten terhadap antibiotik biasa.

Rekomendasi untuk klinisi:

• Pertimbangkan pengangkatan kateter/implan jika memungkinkan.
• Pilihan antibiotik: Rifampisin (penetrasi biofilm baik) dikombinasikan dengan sefazolin atau fosfomisin (untuk MRSA: tambahkan vankomisin atau daptomisin + rifampisin).
• Durasi terapi: ≥ 14-21 hari (atau lebih).
• Pantau respons klinis; jika gagal, pertimbangkan debridemen bedah.

Kontrol Kualitas

Kontrol	Hasil yang diharapkan	Tindakan jika gagal
S. epidermidis ATCC 35984 (biofilm kuat)	OD > 4×ODc (kategori strong)	Ulangi dengan kultur segar; periksa media (TSB + glukosa)
S. epidermidis ATCC 12228 (non-biofilm)	OD ≤ ODc (kategori non)	Pastikan tidak terkontaminasi strain lain
Well kontrol negatif (hanya media)	OD rendah (0.05-0.15)	Jika OD > 0.2, kristal violet terlalu pekat atau pencucian tidak sempurna
Triplo (3 well untuk isolat sama)	Standar deviasi < 10% dari rata-rata	Ulangi jika variasi tinggi (teknik pipetting tidak konsisten)

Keterbatasan Biofilm Test

1. Hanya semi-kuantitatif: Tidak memberikan MBEC (Minimal Biofilm Eradication Concentration).
2. Tidak semua bakteri dapat membentuk biofilm in vitro seperti di in vivo (kondisi lingkungan in vivo berbeda).
3. Kultur planktonik masih diperlukan untuk uji kepekaan antibiotik standar (MIC/disk difusi) yang menggunakan bakteri planktonik, bukan biofilm.
4. Waktu inkubasi 24 jam – tidak bisa untuk laporan cepat (stat).
5. Interpretasi subjektif untuk kategori weak/moderate/strong (perlu standarisasi cut-off antar laboratorium).

Kesimpulan

Biofilm test (metode mikrotiter plate – kristal violet) adalah prosedur sederhana, murah, dan dapat diandalkan untuk menilai kemampuan isolat klinis dalam membentuk biofilm. Dengan mengkategorikan isolat sebagai non, weak, moderate, atau strong biofilm producer, laboratorium memberikan informasi penting bagi klinisi: pasien dengan strong biofilm producer (terutama jika berasal dari infeksi terkait kateter/ implant) memerlukan pengangkatan benda asing dan antibiotik penetrasi biofilm (misal rifampisin) dengan durasi terapi yang lebih panjang.

Laboratorium mikrobiologi di rumah sakit rujukan sebaiknya menyediakan uji ini (setidaknya untuk isolat S. aureus, S. epidermidis, P. aeruginosa, dan K. pneumoniae) karena prevalensi infeksi terkait biofilm sangat tinggi di ICU dan pasien dengan kateter/ventilator. Dengan memahami biofilm test, ATLM tidak hanya melaporkan "kuman X, sensitif terhadap Y", tetapi juga memberikan peringatan dini: "Hati-hati, kuman ini membentuk biofilm – infeksi sulit diobati."

Follow Media Sosial Infolabmed.com melalui chanel Telegram [Link : https://t.me/infolabmedcom], Facebook [Link : https://www.facebook.com/infolabmed/], Twitter/X [Link : https://x.com/infolabmed]. Berikan DONASI terbaikmu untuk perkembangan website infolabmed.com melalui Donasi via DANA https://link.dana.id/minta?full_url=https://qr.dana.id/v1/281012012020092524655592.