Acid-Fast Staining (Ziehl–Neelsen Method): Prinsip, Prosedur, dan Interpretasi Hasil

Table of Contents

INFOLABMED.COM - Dalam dunia mikrobiologi diagnostik, tidak semua bakteri dapat diwarnai dengan metode Gram yang konvensional. Mycobacterium tuberculosis, bakteri penyebab tuberkulosis (TB), memiliki dinding sel yang kaya akan lipid dan asam mikolat, membuatnya sulit ditembus oleh pewarna biasa . Di sinilah peran Acid-Fast Staining (Ziehl–Neelsen Method) menjadi sangat krusial sebagai teknik pewarnaan khusus yang dikembangkan lebih dari seabad yang lalu dan masih menjadi andalan hingga kini.

Metode yang ditemukan oleh dua ilmuwan Jerman, Franz Ziehl (1859-1926) dan Friedrich Neelsen (1854-1894) ini merupakan pewarnaan diferensial yang sangat spesifik untuk mengidentifikasi bakteri tahan asam (BTA), terutama Mycobacterium tuberculosis dan Mycobacterium leprae . Teknik ini memanfaatkan keunikan dinding sel bakteri yang mampu mempertahankan warna primer meskipun dibilas dengan larutan asam-alkohol, berbeda dengan bakteri lain yang akan kehilangan warna tersebut . Artikel ini akan membahas secara komprehensif prinsip, komponen, prosedur, interpretasi hasil, serta aplikasi klinis metode Ziehl-Neelsen.

Prinsip Dasar Pewarnaan Ziehl-Neelsen

Prinsip utama pewarnaan ini terletak pada komposisi unik dinding sel bakteri tahan asam. Mycobacterium memiliki dinding sel yang tebal dengan kandungan lipid tinggi, terutama asam mikolat, yang membentuk lapisan lilin (waxy) dan bersifat hidrofobik . Lapisan inilah yang menyebabkan bakteri ini sulit diwarnai oleh pewarnaan Gram biasa.

Acid-Fast Staining (Ziehl–Neelsen Method) menggunakan tiga larutan utama dengan fungsi spesifik :

1. Cat Primer (Carbol fuchsin 1%): Mengandung fenol yang membantu penetrasi cat ke dalam dinding sel lipid. Pemanasan saat pewarnaan membuat dinding sel lebih permeabel, sehingga carbol fuchsin dapat masuk dan berikatan dengan sitoplasma .
2. Larutan Pencuci (Asam alkohol 3%): Berfungsi sebagai decolorizing agent. Bakteri non-BTA akan kehilangan warna merah karena catnya larut dalam asam-alkohol. Sebaliknya, bakteri BTA yang telah mengikat cat primer dengan kuat akan menahan warna merah tersebut (tahan terhadap asam) .
3. Cat Lawan (Methylene blue 0,1%): Memberikan warna kontras. Bakteri non-BTA dan sel-sel lain yang telah kehilangan warna merah akan menyerap cat biru ini, sehingga tampak biru di bawah mikroskop .

Komponen Reagen

Komposisi reagen untuk pewarnaan Ziehl-Neelsen secara umum adalah sebagai berikut :

Reagen	Komposisi Utama	Fungsi
Carbol fuchsin	Carbol fuchsin, Phenol	Cat primer, mewarnai BTA merah
Asam alkohol	Ethanol, Asam klorida (HCl)	Larutan pemucat/dekolorisasi
Methylene blue	Methylene blue	Cat lawan (counterstain), mewarnai latar belakang dan bakteri non-BTA biru

Prosedur Pewarnaan Ziehl-Neelsen Step by Step

Berikut adalah prosedur standar pewarnaan BTA metode Ziehl-Neelsen yang direkomendasikan untuk pemeriksaan sputum tuberkulosis :

1. Persiapan Sampel dan Pembuatan Apusan

• Pengambilan sputum: Sputum yang baik adalah yang purulen (bernanah) atau mukoid, diambil dengan metode Sewaktu-Pagi-Sewaktu (SPS) .
• Pembuatan preparat: Ambil bagian sputum yang purulen menggunakan lidi pipih, buat apusan di atas kaca objek bersih dengan ukuran sekitar 2x3 cm (oval). Ratakan dengan gerakan spiral (coil type) menggunakan lidi lancip .
• Pengeringan: Biarkan apusan mengering pada suhu ruang .

2. Fiksasi

Fiksasi dilakukan dengan melewatkan preparat di atas api bunsen (bagian api biru) sebanyak 2-3 kali selama 1-2 detik. Tujuannya untuk mematikan bakteri dan menempelkan apusan pada kaca objek .

3. Pewarnaan Primer

• Genangi sediaan dengan larutan Carbol fuchsin.
• Panaskan preparat di atas rak pengecatan dengan api bunsen sampai keluar uap (sekitar 60°C), jangan sampai mendidih karena dapat menimbulkan endapan kristal .
• Matikan api, biarkan cat bekerja selama 5 menit. Jika perlu, tambahkan cat agar sediaan tidak kering .
• Bilas dengan air mengalir perlahan .

4. Dekolorisasi (Pemucatan)

• Genangi sediaan dengan larutan asam alkohol 3% selama 1-2 menit atau sampai tidak ada lagi warna merah yang luruh (warna merah pada sediaan tampak pucat) .
• Bilas dengan air mengalir .

5. Pewarnaan Lawan (Counterstain)

• Genangi sediaan dengan larutan methylene blue 0,1% selama 30-60 detik .
• Bilas dengan air mengalir, keringkan pada rak pengering .

6. Pembacaan Mikroskopis

• Amati sediaan dengan mikroskop lensa objektif 100x menggunakan minyak imersi .
• Penting: Jangan menggunakan minyak cedar (cedarwood oil) karena dapat melarutkan kompleks warna merah pada BTA .

Interpretasi Hasil dan Kualitas Sediaan

Hasil Pewarnaan

Di bawah mikroskop dengan latar belakang biru, hasil yang terlihat adalah :

• Bakteri Tahan Asam (BTA) positif: Tampak sebagai basil (batang) berwarna merah, sedikit melengkung, bisa tersusun sendiri-sendiri, berpasangan, atau bergerombol.
• Bakteri non-BTA dan sel-sel lain: Tampak berwarna biru.

Kualitas Sediaan yang Baik

Sebelum dilakukan pembacaan, kualitas sediaan apusan harus dipastikan, antara lain :

• Sputus yang digunakan adalah bagian purulen (mengandung banyak leukosit PMN).
• Ukuran apusan sesuai (2x3 cm), tidak terlalu tebal atau tipis.
• Tidak ada endapan kristal atau sisa cat yang mengganggu.

Waktu Pemanasan Optimal

Penelitian menunjukkan bahwa waktu pemanasan karbol fuksin berpengaruh terhadap hasil pewarnaan. Pemanasan selama 10 detik (sampai muncul uap) terbukti memberikan hasil pewarnaan paling baik dengan kontras yang jelas antara bakteri merah dan latar belakang biru .

Aplikasi Klinis dan Pentingnya Metode ZN

1. Diagnosis Tuberkulosis (TB)

Pewarnaan Ziehl-Neelsen pada spesimen sputum merupakan alat diagnosis paling efisien untuk mendeteksi tersangka TB paru, terutama di negara berkembang dengan sumber daya terbatas . Indikasi pemeriksaan meliputi batuk kronis, hemoptisis (batuk darah), demam tidak jelas, dan penurunan berat badan .

2. Diagnosis Lepra (Morbus Hansen)

Metode ini juga digunakan untuk mendeteksi Mycobacterium leprae pada pemeriksaan kerokan kulit (skin-slit smear) dari lesi atau cuping telinga . Diagnosis lepra ditegakkan jika ditemukan BTA pada pemeriksaan tersebut .

3. Jaringan dan Cairan Tubuh Lainnya

Pewarnaan ZN dapat diaplikasikan pada berbagai spesimen klinis seperti cairan serebrospinal (LCS), bilasan bronkus (BAL), biopsi, jaringan, urin, dan cairan tubuh lainnya .

Keterbatasan Metode Ziehl-Neelsen

Meskipun menjadi andalan, metode ini memiliki keterbatasan :

• Sensitivitas lebih rendah dibandingkan kultur atau tes molekuler (PCR). Bakteri dalam jumlah sedikit mungkin tidak terdeteksi.
• Tidak dapat membedakan spesies Mycobacterium (misal antara M. tuberculosis kompleks dan mikobakteria atipikal).
• Hasil positif palsu dapat terjadi jika ada bakteri non-tuberkulosis yang juga bersifat tahan asam (misal Nocardia) .

Oleh karena itu, untuk identifikasi lengkap dan uji kepekaan obat, pemeriksaan lanjutan dengan kultur (media Lowenstein-Jensen atau MGIT) atau tes molekuler sangat direkomendasikan .

Kesimpulan

Acid-Fast Staining (Ziehl–Neelsen Method) adalah teknik pewarnaan diferensial yang esensial dalam mikrobiologi diagnostik, khususnya untuk deteksi bakteri tahan asam seperti Mycobacterium tuberculosis dan Mycobacterium leprae. Prinsipnya memanfaatkan dinding sel kaya lipid yang mampu mempertahankan cat karbol fuksin meskipun dibilas dengan asam-alkohol .

Prosedur pewarnaan yang benar, mulai dari pembuatan apusan, fiksasi, pewarnaan primer dengan pemanasan, dekolorisasi, hingga pewarnaan lawan, sangat menentukan kualitas hasil . Bakteri BTA akan tampak sebagai basil merah dengan latar belakang biru.

Metode ini tetap menjadi alat skrining utama untuk tuberkulosis di seluruh dunia karena murah, cepat, dan relatif sederhana . Namun, hasil negatif tidak selalu menyingkirkan TB, dan hasil positif perlu diinterpretasikan bersama gejala klinis serta dapat dikonfirmasi dengan metode yang lebih sensitif seperti kultur atau PCR . Dengan memahami dan mengaplikasikan metode Ziehl-Neelsen dengan tepat, tenaga laboratorium berkontribusi besar dalam pengendalian penyakit tuberkulosis.

Tetap ikuti perkembangan terbaru seputar dunia mikrobiologi dan laboratorium medis hanya di Infolabmed. Follow Media Sosial Infolabmed.com melalui chanel Telegram [Link : https://t.me/infolabmedcom], Facebook [Link : https://www.facebook.com/infolabmed/], Twitter/X [Link : https://x.com/infolabmed]. Berikan DONASI terbaikmu untuk perkembangan website infolabmed.com melalui Donasi via DANA https://link.dana.id/minta?full_url=https://qr.dana.id/v1/281012012020092524655592.