Elisa: Panduan Lengkap Metodologi Uji Imunosorben Terpaut Enzim

Table of Contents

 

INFOLABMED.COM - ELISA adalah teknik laboratorium yang sangat kuat dan banyak digunakan dalam berbagai bidang.

Nama lengkapnya adalah Enzyme-Linked Immunosorbent Assay.

Teknik ini memungkinkan deteksi dan kuantifikasi spesifik antigen atau antibodi dalam sampel.

ELISA telah merevolusi diagnostik medis, penelitian biologi, dan pengawasan kualitas makanan.

Kemampuannya untuk mendeteksi keberadaan biomolekul dalam konsentrasi yang sangat rendah menjadikannya instrumen tak ternilai.

Artikel ini akan menguraikan metodologi ELISA secara komprehensif.

Kita akan membahas prinsip dasar, komponen utama, berbagai jenis, dan aplikasinya.

Prinsip Dasar ELISA

Prinsip utama ELISA didasarkan pada ikatan spesifik antara antigen dan antibodi.

Interaksi ini dikenal sebagai reaksi imun.

ELISA memanfaatkan enzim sebagai penanda untuk menghasilkan sinyal yang dapat diukur.

Enzim ini biasanya terkonjugasi ke antibodi atau antigen.

Sinyal tersebut dihasilkan ketika substrat yang sesuai ditambahkan.

Reaksi enzim-substrat menghasilkan perubahan warna yang proporsional.

Intensitas perubahan warna dapat diukur secara spektrofotometri.

Pengukuran ini memungkinkan kuantifikasi analit yang dicari.

Komponen Utama ELISA

Beberapa komponen krusial diperlukan untuk melakukan pengujian ELISA.

Antigen adalah molekul target yang ingin dideteksi atau, dalam beberapa kasus, digunakan untuk mendeteksi antibodi.

Antibodi adalah protein imun yang secara spesifik mengikat antigen tertentu.

Antibodi Primer adalah antibodi yang pertama kali mengikat antigen target.

Antibodi Sekunder adalah antibodi yang mengikat antibodi primer dan biasanya terkonjugasi dengan enzim.

Enzim Konjugat adalah enzim (seperti Horseradish Peroxidase, HRP, atau Alkaline Phosphatase, AP) yang terikat pada antibodi atau antigen.

Substrat adalah senyawa yang akan diubah oleh enzim menjadi produk berwarna.

Larutan Pencuci digunakan untuk menghilangkan reagen yang tidak terikat secara non-spesifik.

Microplate biasanya pelat 96-sumur yang terbuat dari polistirena, tempat reaksi terjadi.

Pembaca Microplate adalah spektrofotometer yang dirancang untuk membaca absorbansi dalam sumur pelat.

Jenis-Jenis ELISA

Ada beberapa format ELISA yang berbeda, masing-masing dengan kelebihan dan kekurangannya.

Pilihan format tergantung pada analit yang akan diukur dan sensitivitas yang dibutuhkan.

ELISA Langsung (Direct ELISA)

Ini adalah format ELISA yang paling sederhana.

Antigen diserap langsung ke permukaan sumur microplate.

Antibodi primer yang sudah terkonjugasi dengan enzim kemudian ditambahkan.

Antibodi ini akan mengikat antigen secara spesifik.

Setelah pencucian, substrat ditambahkan.

Reaksi enzim-substrat menghasilkan sinyal yang dapat diukur.

Prosedur ELISA Langsung:

• Lapisi sumur dengan antigen target.
• Blokir situs pengikatan yang tidak spesifik.
• Tambahkan antibodi primer berlabel enzim yang spesifik terhadap antigen.
• Cuci untuk menghilangkan antibodi yang tidak terikat.
• Tambahkan substrat enzim.
• Ukur absorbansi yang dihasilkan.

ELISA Tidak Langsung (Indirect ELISA)

ELISA tidak langsung digunakan secara luas untuk mendeteksi antibodi dalam sampel.

Antigen target dilapisi pada sumur microplate.

Sampel yang mengandung antibodi primer (misalnya, serum pasien) ditambahkan.

Jika ada, antibodi primer akan mengikat antigen yang dilapisi.

Kemudian, antibodi sekunder berlabel enzim yang spesifik terhadap antibodi primer ditambahkan.

Antibodi sekunder ini akan mengikat antibodi primer yang terikat.

Setelah pencucian, penambahan substrat akan menghasilkan sinyal.

Metode ini cenderung lebih sensitif daripada ELISA langsung.

Prosedur ELISA Tidak Langsung:

• Lapisi sumur dengan antigen target.
• Blokir situs pengikatan yang tidak spesifik.
• Tambahkan antibodi primer (dari sampel) yang spesifik terhadap antigen.
• Cuci untuk menghilangkan antibodi primer yang tidak terikat.
• Tambahkan antibodi sekunder berlabel enzim yang spesifik terhadap antibodi primer.
• Cuci untuk menghilangkan antibodi sekunder yang tidak terikat.
• Tambahkan substrat enzim.
• Ukur absorbansi yang dihasilkan.

ELISA Sandwich

ELISA sandwich adalah format yang paling umum digunakan untuk mendeteksi antigen.

Metode ini dikenal karena sensitivitas dan spesifisitasnya yang tinggi.

Antibodi penangkap (capture antibody) dilapisi pada sumur microplate.

Antibodi penangkap ini akan mengikat antigen target dari sampel.

Antigen yang terikat kemudian dideteksi oleh antibodi kedua, yang disebut antibodi deteksi.

Antibodi deteksi ini dapat langsung terkonjugasi dengan enzim.

Atau, antibodi deteksi dapat diikat oleh antibodi sekunder berlabel enzim.

Setelah penambahan substrat, sinyal akan dihasilkan.

Prosedur ELISA Sandwich:

• Lapisi sumur dengan antibodi penangkap spesifik.
• Blokir situs pengikatan yang tidak spesifik.
• Tambahkan sampel yang mengandung antigen target.
• Cuci untuk menghilangkan antigen yang tidak terikat.
• Tambahkan antibodi deteksi (berlabel enzim atau tidak berlabel).
• Jika tidak berlabel, tambahkan antibodi sekunder berlabel enzim.
• Cuci untuk menghilangkan antibodi yang tidak terikat.
• Tambahkan substrat enzim.
• Ukur absorbansi yang dihasilkan.

ELISA Kompetitif (Competitive ELISA)

ELISA kompetitif digunakan ketika ukuran analit terlalu kecil untuk diikat oleh dua antibodi secara bersamaan.

Format ini juga ideal untuk analit dengan konsentrasi sangat rendah.

Ada dua pendekatan umum untuk ELISA kompetitif.

Dalam satu varian, antibodi yang tidak berlabel dari sampel bersaing dengan antibodi berlabel enzim untuk mengikat antigen yang dilapisi.

Semakin banyak analit dalam sampel, semakin sedikit antibodi berlabel enzim yang terikat.

Akibatnya, semakin rendah sinyal yang dihasilkan.

Ini berarti ada hubungan berbanding terbalik antara konsentrasi analit dan sinyal.

Prosedur ELISA Kompetitif (Varian 1):

• Lapisi sumur dengan antigen target.
• Blokir situs pengikatan yang tidak spesifik.
• Tambahkan campuran sampel (mengandung analit) dan antibodi berlabel enzim.
• Analit dari sampel bersaing dengan antibodi berlabel untuk mengikat antigen yang dilapisi.
• Cuci untuk menghilangkan reagen yang tidak terikat.
• Tambahkan substrat enzim.
• Ukur absorbansi yang dihasilkan (semakin tinggi analit, semakin rendah sinyal).

Deteksi dan Interpretasi Hasil

Setelah penambahan substrat, reaksi enzim menghasilkan produk berwarna.

Intensitas warna ini diukur menggunakan pembaca microplate atau spektrofotometer.

Pembacaan dilakukan pada panjang gelombang yang sesuai untuk produk berwarna.

Data absorbansi ini kemudian diplot terhadap konsentrasi standar yang diketahui.

Kurva standar ini memungkinkan penentuan konsentrasi analit dalam sampel yang tidak diketahui.

Hasil dapat dinyatakan secara kualitatif (positif/negatif) atau kuantitatif.

Kuantifikasi memerlukan kurva standar yang akurat dan kontrol kualitas yang ketat.

Aplikasi ELISA

ELISA memiliki berbagai aplikasi di berbagai bidang.

Diagnostik Medis: Deteksi infeksi virus (HIV, Hepatitis), bakteri, parasit, dan hormon.

Skrining Penyakit: Digunakan untuk skrining kanker dan penyakit autoimun.

Keamanan Pangan: Deteksi alergen, toksin, dan patogen dalam makanan.

Penelitian Biologi: Studi ekspresi protein, interaksi protein-protein, dan pengembangan vaksin.

Farmasi: Pengujian kemurnian produk biologis dan pengembangan obat baru.

Veteriner: Diagnosa penyakit pada hewan dan pemantauan kesehatan ternak.

ELISA terus menjadi alat diagnostik dan penelitian yang tak tergantikan.