Western Blot: Menguak Skema Prinsip dan Prosedur Deteksi Protein secara Spesifik

Table of Contents

 

INFOLABMED.COM - Dalam dunia penelitian biologi molekuler dan diagnostik, Western Blot (atau Immunoblot) merupakan salah satu teknik yang dianggap sebagai "standar emas" untuk mendeteksi dan menganalisis protein spesifik dalam sebuah sampel campuran yang kompleks. 

Teknik ini menggabungkan kekuatan resolusi elektroforesis dengan spesifisitas tinggi dari antibodi, memungkinkan ilmuwan untuk mengonfirmasi tidak hanya ada tidaknya suatu protein target, tetapi juga memperkirakan berat molekul dan kuantitasnya.

Baca Juga: Tes Western Blot Antigen dan Antibodi HIV: Konfirmasi Hasil Positif

Apa Itu Western Blot?

Western Blot adalah teknik analitis yang digunakan untuk mengidentifikasi protein spesifik berdasarkan kemampuan antibodi untuk berikatan secara spesifik dengan protein target tersebut. 

Teknik ini terdiri dari tiga proses utama: pemisahan protein berdasarkan ukuran, transfer protein ke membran, dan deteksi protein target menggunakan antibodi.

Prinsip Dasar Western Blot

Prinsip kerja Western Blot bergantung pada spesifisitas ikatan antigen-antibodi. 

Protein yang dipisahkan berdasarkan berat molekulnya kemudian ditransfer ke sebuah membran. 

Protein target kemudian dideteksi menggunakan antibodi primer yang spesifik mengenali epitop pada protein tersebut, dan kemudian antibodi sekunder yang berkonjugasi dengan enzim atau fluorofor yang mengenali antibodi primer. 

Sinyal yang dihasilkan kemudian divisualisasikan.

Aplikasi Western Blot

Teknik ini memiliki aplikasi yang sangat luas, antara lain:

• Konfirmasi Hasil ELISA atau PCR: Misalnya, konfirmasi diagnosis HIV dan Lyme disease.
• Analisis Ekspresi Protein: Membandingkan tingkat ekspresi protein tertentu di bawah kondisi yang berbeda.
• Penelitian Signal Transduksi: Mempelajari fosforilasi protein dan modifikasi pasca-translasi lainnya.
• Kontrol Kualitas: Memastikan kemurnian protein yang dimurnikan.

Skema dan Tahapan Prinsip Western Blot

Prosedur Western Blot adalah proses multi-tahap yang membutuhkan ketelitian tinggi. Berikut adalah skema tahapannya:

1. Preparasi Sampel dan Elektroforesis (SDS-PAGE) Sampel jaringan atau sel dilisis untuk mengekstrak protein total. Protein kemudian dicampur dengan buffer sampel yang mengandung SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) dan β-mercaptoethanol. SDS melapisi protein dengan muatan negatif, sementara β-mercaptoethanol memutus ikatan disulfida. Campuran ini kemudian dipanaskan (denaturasi). Sampel yang telah didenaturasi kemudian dimuat ke dalam gel poliakrilamid (SDS-PAGE) dan dipisahkan berdasarkan ukuran molekulnya ketika dialiri arus listrik. Protein kecil bergerak lebih cepat daripada protein besar.

2. Transfer (Blotting) Setelah pemisahan, protein dalam gel harus dipindahkan (diblot) ke membran yang kokoh, biasanya membran nitroselulosa atau PVDF (Polyvinylidene Difluoride). Transfer dilakukan dengan menggunakan arus listrik (semi-dry atau wet transfer) yang membuat protein bermuatan negatif bermigrasi dari gel ke membran. Setelah transfer, semua situs pengikatan pada membran yang masih kosong diblokir dengan protein inert (seperti BSA atau susu skim) untuk mencegah antibodi menempel secara non-spesifik.

3. Immunodeteksi (Probing dengan Antibodi) Tahap inti dari Western Blot. Membran kemudian diinkubasi secara berurutan dengan dua jenis antibodi:

• Antibodi Primer: Antibodi yang spesifik mengikat protein target. Inkubasi dilakukan selama beberapa jam atau semalam.
• Antibodi Sekunder: Antibodi yang dikonjugasi dengan enzim (biasanya HRP - Horseradish Peroxidase) yang dapat mengenali dan berikatan dengan antibodi primer. Antibodi sekunder ini yang akan menghasilkan sinyal.

4. Visualisasi (Deteksi Sinyal) Membran dicuci untuk menghilangkan antibodi yang tidak terikat. Sinyal dideteksi dengan menambahkan substrat untuk enzim yang terikat. Untuk HRP, substrat kimia (seperti ECL) akan menghasilkan cahaya (chemiluminescence) ketika bereaksi dengan enzim. Cahaya ini kemudian ditangkap oleh film sinar-X atau kamera CCD khusus. Intensitas pita yang terbentuk sebanding dengan jumlah protein target.

Interpretasi Hasil

Hasil Western Blot ditunjukkan oleh adanya pita (band) pada posisi tertentu di membran. 

Posisi pita dibandingkan dengan penanda berat molekul (ladder) untuk mengonfirmasi ukuran protein target. Hasil positif ditandai dengan munculnya pita pada ukuran yang diharapkan.

Kelebihan dan Kekurangan

Kelebihan:

• Spesifisitas dan sensitivitas yang sangat tinggi.
• Dapat mendeteksi modifikasi pasca-translasi (seperti fosforilasi).
• Dapat memberikan informasi tentang ukuran protein.

Kekurangan:

• Prosedur yang memakan waktu (biasanya 1-3 hari).
• Memerlukan antibodi yang spesifik dan berkualitas baik.
• Kuantifikasi bersifat semi-kuantitatif, bukan absolut.

Skema prinsip Western Blot tetap menjadi pilar fundamental dalam biokimia dan biologi molekuler. 

Baca Juga: Peran Tenaga Laboratorium Medik dalam Deteksi Dini HIV

Meskipun prosedurnya rumit, kekuatan dan reliabilitasnya dalam mendeteksi protein spesifik menjadikannya alat yang indispensable untuk penelitian dasar, pengembangan obat, dan diagnosis klinis. 

Pemahaman mendalam tentang setiap tahapannya sangat penting untuk memperoleh hasil yang akurat dan dapat dipercaya.

---

Follow Media Sosial Infolabmed.com melalui Telegram, Facebook, Twitter/X. Dukung pengembangan website kami melalui Donasi via DANA.

---