Prosedur Isolasi DNA: Panduan Lengkap Langkah Demi Langkah untuk Berbagai Sampel Biologis

Table of Contents

 

INFOLABMED.COM - Isolasi DNA merupakan teknik fundamental dan merupakan langkah pertama yang kritis dalam hampir semua analisis biologi molekuler, mulai dari PCR, sequencing, hingga diagnostik genetik. 

Prosedur isolasi DNA bertujuan untuk memisahkan dan memurnikan DNA dari materi seluler lainnya seperti protein, RNA, lemak, dan karbohidrat. 

Baca Juga: Mengenal Komponen-Komponen Utama dalam Reaksi PCR

Memahami prosedur isolasi DNA yang benar sangat penting untuk memperoleh DNA dengan kuantitas dan kualitas yang tinggi, yang akan menentukan keberhasilan aplikasi downstream.

Prinsip Dasar Prosedur Isolasi DNA

Secara universal, prosedur isolasi DNA didasarkan pada tiga tahap utama:

1. Lisis (Pemecahan Sel): Memecahkan dinding dan membran sel untuk melepaskan isi sel, termasuk DNA, ke dalam larutan.
2. Penghilangan Kontaminan: Memisahkan DNA dari komponen sel lain yang tidak diinginkan (protein, RNA, dll.).
3. Presipitasi dan Pemurnian DNA: Mengendapkan dan melarutkan kembali DNA dalam buffer yang sesuai untuk penyimpanan atau analisis lebih lanjut.

Langkah-Langkah Prosedur Isolasi DNA (Metode Kimia)

Berikut adalah penjelasan detail dari prosedur isolasi DNA yang umum dilakukan:

1. Persiapan Sampel Sampel (darah, jaringan, sel bukal, dll.) dipersiapkan terlebih dahulu. Jaringan digerus, sel diencerkan, atau darah dicuci untuk menghilangkan inhibitor. Sampel yang digunakan harus segar atau disimpan dengan benar (pada -20°C atau -80°C) untuk mencegah degradasi DNA.

2. Lisis Sel Sampel dicampur dengan buffer lisis yang mengandung:

• Detergen (seperti SDS atau CTAB): Untuk melarutkan membran lemak sel dan nukleus.
• Proteinase K: Enzim yang mendegradasi protein, termasuk histon yang membungkus DNA.
• Larutan Garam (Buffer): Untuk membantu mempertahankan kondisi ionic yang optimal. Campuran ini kemudian diinkubasi pada suhu tertentu (biasanya 50-60°C) selama beberapa jam hingga semalam untuk memastikan sel terlisis sempurna.

3. Pemurnian DNA dari Kontaminan

• Penambahan Fenol-Kloroform: Campuran fenol-kloroform digunakan untuk memisahkan larutan berdasarkan fase. Protein dan lipid akan larut dalam fase organik (fenol) dan fase interphase, sementara DNA akan tetap berada dalam fase air (aqueous). Sentrifugasi dilakukan untuk memisahkan ketiga fase ini dengan jelas.
• Penambahan RNase: Untuk menghilangkan kontaminasi RNA, enzim RNase ditambahkan dan diinkubasi singkat.

4. Presipitasi DNA DNA dalam fase aqueous kemudian dipresipitasi (diendapkan) dengan menambahkan:

• Etanol Absolut atau Isopropanol dalam jumlah tertentu dan pada suhu dingin.
• Garam (seperti ammonium asetat atau sodium asetat) untuk membantu pengendapan DNA. Setelah dikocok perlahan, DNA akan terlihat seperti benang putih yang menggumpal.

5. Pencucian Gumpalan DNA dicuci dengan etanol 70% untuk menghilangkan garam dan pengotor yang masih tersisa. Campuran disentrifugasi kembali dan supernatant (cairannya) dibuang.

6. Pelarutan Kembali (Rehidrasi) Gumpalan DNA murni kemudian dikeringanginkan sebentar untuk menguapkan sisa etanol, lalu dilarutkan kembali dalam buffer TE (Tris-EDTA) atau air bebas nuklease. EDTA berfungsi untuk mengikat ion magnesium yang merupakan kofaktor untuk enzim nuklease, sehingga melindungi DNA dari degradasi.

Metode Alternatif: Menggunakan Kit Komersial

Prosedur isolasi DNA modern banyak menggunakan kit komersial berbasis kolom silika atau partikel magnetik. Prinsipnya adalah DNA dapat terikat secara spesifik pada silika dalam kondisi garam tinggi dan pH tertentu. Prosedurnya lebih cepat, aman (menghindari fenol yang beracun), dan mudah diotomasi.

1. Lisis: Sampel dilisis dengan buffer khusus.
2. Binding: Lysat dimasukkan ke kolom, DNA terikat pada membran silika.
3. Pencucian: Kolom dicuci dengan buffer ethanol untuk membersihkan pengotor.
4. Elusi: DNA murni dielusi dengan air atau buffer rendah garam.

Faktor Penentu Keberhasilan

• Kualitas Sampel: Sampel yang segar dan tidak terdegradasi.
• Menghindari Kontaminasi: Gunakan alat dan tip yang steril, serta bekerja di area yang bersih.
• Waktu dan Suhu: Mengikuti waktu inkubasi dan suhu yang direkomendasikan.
• Kehati-hatian: Terutama pada saat memisahkan fase aqueous dan mencuci pellet DNA.

Baca Juga: Preparasi DNA Bakteriofag dan Tanaman: Teknik dan Aplikasinya dalam Diagnostik Genetik

Penguasaan prosedur isolasi DNA merupakan keterampilan dasar yang wajib dikuasai di laboratorium molekuler. 

Mulai dari metode konvensional fenol-kloroform hingga kit kolom yang praktis, pemahaman mendalam tentang setiap langkah akan memastikan diperolehnya DNA dengan kemurnian dan integritas yang optimal untuk mendukung segala bentuk analisis genetik selanjutnya.

---

Follow Media Sosial Infolabmed.com melalui chanel Telegram [Link Telegram], Facebook [Link Facebook], Twitter/X [Link Twitter]. Berikan DONASI terbaikmu untuk perkembangan website infolabmed.com melalui Donasi via DANA.