Mengenal Fungsi Reagen dalam Isolasi DNA dan RNA serta Mekanisme Kerjanya

Table of Contents

 

INFOLABMED.COM – Proses ekstraksi DNA dari jaringan yang diawetkan dalam parafin (FFPE) merupakan langkah penting dalam berbagai analisis laboratorium, seperti identifikasi genetik dan penelitian penyakit. 

Namun, sebelum ekstraksi DNA dapat dilakukan, parafin yang digunakan untuk mengawetkan jaringan harus dihilangkan terlebih dahulu. Berikut adalah prosedur yang umum digunakan:

Reagen yang Diperlukan:

• Oktana atau xilena
• Etanol 100%
• Aseton
• Proteinase K (20 mg/mL)
• Buffer pencerna: 50 mM Tris HCl (pH 8,5), 1 mM EDTA, 0,5% Tween 20 atau 1% Laureth 12

Persiapan Irisan Jaringan:

1. Siapkan irisan jaringan dengan ketebalan 5–10 μm menggunakan mikrotom dari jaringan yang diawetkan.
2. Jika memungkinkan, hilangkan parafin berlebihan dari sampel sebelum diiris.
3. Ambil irisan jaringan dan letakkan dalam tabung mikrosentrifuge 1,5 mL dalam keadaan kering.
4. Untuk mencegah kontaminasi, bersihkan mikrotom dengan xilena setelah digunakan untuk menyiapkan irisan sampel jaringan yang berbeda.

Penghilangan Parafin dari Irisan Jaringan:

1. Tambahkan 1 mL oktana ke dalam tabung yang berisi irisan jaringan.
2. Tutup tabung dan campurkan pada suhu kamar selama 30 menit.
3. Lakukan sentrifugasi pada kecepatan penuh (13.000–16.000 rpm) selama 5 menit sehingga jaringan dan sisa-sisa parafin mengendap.
4. Buang cairan oktana dengan menggunakan pipet Pasteur.
5. Ulangi langkah 1–4.
6. Tambahkan 0,5 mL etanol 100% ke dalam tabung, tutup, dan campurkan dengan cara membalikkan tabung.
7. Lakukan sentrifugasi seperti langkah 3.
8. Buang etanol seperti langkah 4.
9. Ulangi langkah 6–8.
10. Keringkan sampel dalam keadaan vakum sampai seluruh etanol menguap.
11. Penghilangan etanol juga dapat dilakukan dengan menambahkan 2–3 tetes aseton ke dalam tabung, membuka tabung, dan meletakkannya dalam waterbath bersuhu 37–50°C sehingga asetonnya menguap.

Ekstraksi DNA:

1. Tambahkan 100 μL buffer pencerna yang mengandung 200 μg/mL proteinase K ke dalam sampel jaringan yang telah diekstraksi.
2. Jika jaringan yang digunakan cukup banyak, gunakan 200 μL buffer pencerna.
3. Inkubasi selama 3 jam pada suhu 55°C atau pada suhu 37°C selama semalam.
4. Lakukan sentrifugasi singkat untuk menghilangkan cairan yang ada pada tutup tabung.
5. Inkubasi pada suhu 95°C selama 8–10 menit untuk menonaktifkan protease.
6. Lakukan sentrifugasi selama 30 detik untuk mengendapkan sisa-sisa parafin atau jaringan.
7. Gunakan supernatan untuk melakukan amplifikasi dengan PCR (1–10 μL).
8. Sampel yang tersisa dapat disimpan pada suhu -20°C.

Perlu dicatat bahwa hasil PCR yang menggunakan sampel DNA yang diekstraksi dari jaringan yang diawetkan dalam parafin mungkin tidak seefisien hasil PCR yang menggunakan DNA yang sudah dimurnikan. 

Oleh karena itu, perlu dilakukan modifikasi parameter amplifikasi, seperti meningkatkan waktu inkubasi pada masing-masing suhu, misalnya dari 30 detik menjadi 1 menit, dan menggunakan siklus amplifikasi yang lebih banyak, misalnya 40 siklus.

Artikel ini diharapkan dapat memberikan panduan yang jelas dan praktis bagi para profesional laboratorium dalam melakukan penghilangan parafin dan ekstraksi DNA dari jaringan yang diawetkan dalam parafin. 

Proses ini sangat penting untuk memastikan kualitas dan kuantitas DNA yang optimal untuk analisis selanjutnya.