Teknik Pewarnaan Albert: Metode Pewarnaan Khusus untuk Struktur Bakteri yang Spesial

Table of Contents

 

Teknik Pewarnaan Albert. (Foto: microrao.com)

INFOLABMED.COM - Teknik pewarnaan Albert merupakan salah satu jenis teknik pewarnaan khusus yang digunakan untuk mendemonstrasikan struktur khusus pada bakteri. 

Teknik pewarnaan Albert  utamanya digunakan untuk menunjukkan granula metakromatis yang ditemukan pada Corynebacterium diphtheriae.

 Bakteri ini bertanggung jawab atas penyakit difteri. Nama Corynebacterium berasal dari kata Yunani "Coryne", yang mengacu pada bentuk tongkat dari bakteri yang terlihat pada kultur yang sudah tua.

 Granula penyimpanan pada bakteri ini disebut granula metakromatis karena menunjukkan sifat metakromasia, di mana granula tersebut muncul dalam warna yang berbeda dari warna yang digunakan untuk pewarnaan. 

Ketika diwarnai dengan metilen biru polikrom, granula tersebut muncul ungu sementara bagian lain dari basilus muncul biru. 

Granula tersebut terdiri dari polimetaphosphates dan dikenal dengan berbagai nama lain seperti tubuh volutin, granula Babe-Ernst, atau tubuh kutub. 

Bakteri tersebut menghasilkan granula dengan jumlah yang melimpah ketika dibiakkan pada medium yang kaya nutrisi seperti slope serum Loeffler.

Reagen Albert dan Proses Pewarnaannya

Ketika diwarnai dengan pewarna Albert, basilus akan berwarna hijau sedangkan granula akan berwarna hitam kebiruan.

 Ada dua reagen yang digunakan dalam proses pewarnaan ini: larutan A Albert dan larutan B Albert.

 Larutan A Albert terdiri dari toluena biru, hijau malakit, asam asetat glasial, dan alkohol etil. Larutan B Albert mengandung Iodium dan Kalium iodida dalam air.

Persyaratan dan Prosedur Pewarnaan Albert

Persyaratan untuk melakukan pewarnaan ini antara lain preparat saput pada slide kaca, rak pewarnaan, larutan A Albert, larutan B Albert, kertas penyerap, minyak penenggelaman, dan mikroskop.

 Prosedur pewarnaannya adalah sebagai berikut:

1. Letakkan slide pada rak pewarnaan dengan saput menghadap ke atas.
2. Tutup saput dengan larutan A Albert dan biarkan selama 7 menit.
3. Tuang larutan pewarna dan bilas slide dalam larutan B Albert (BUKAN air keran).
4. Letakkan slide kembali pada rak dan tutup saput dengan larutan B Albert dan biarkan selama dua menit.
5. Tuangkan pewarna dan bilas slide dalam air keran.
6. Keringkan slide menggunakan kertas penyerap, teteskan minyak penenggelaman pada saput, dan amati di bawah objektif penenggelaman minyak.

Pengamatan dan Interpretasi

Hasil pengamatan akan menunjukkan basilus berwarna hijau yang berbentuk batang dan tersusun dengan sudut satu sama lain menyerupai huruf 'L' atau 'V' dalam bahasa Inggris atau pola huruf Tionghoa, serta granula metakromatis berwarna hitam kebiruan di kutub.

 Dari pengamatan ini, dapat disimpulkan bahwa preparat tersebut mengandung bakteri yang secara morfologis menyerupai Corynebacterium diphtheriae.

Pertanyaan Umum tentang Teknik Pewarnaan Bakteri

Bagaimana teknik pewarnaan diklasifikasikan?

• Pewarnaan sederhana: di mana hanya satu pewarna digunakan dan semua bakteri diwarnai secara serupa. Contohnya: Metilen biru, karbol fuksin encer.
• Pewarnaan diferensial: di mana berbagai bakteri diwarnai secara berbeda tergantung pada sifat fisiologisnya. Contohnya: Pewarnaan Gram dan pewarnaan tahan asam.
• Pewarnaan khusus: di mana struktur bakteri seperti spora, granula, kapsul, dll. ditunjukkan. Contohnya: teknik impregnasi perak untuk demonstrasi spiroket, pewarnaan Feulgen untuk demonstrasi inti, pewarnaan Sudan hitam untuk demonstrasi vakuola lipid, pewarnaan Ryu untuk demonstrasi flagela, pewarnaan Albert untuk demonstrasi granula metakromatik.
• Pewarnaan negatif: di mana latar belakang diwarnai dengan pewarna asam seperti tinta India atau Nigrosin. Digunakan untuk demonstrasi kapsul.

Bagaimana pewarnaan diklasifikasikan?

• Pewarna diklasifikasikan berdasarkan pH kromofor mereka (ion pembawa warna) menjadi asam, basa, dan netral. Pewarna asam memiliki kromofor anionik, misalnya, eosinat natrium. Pewarna basa memiliki kromofor kationik, misalnya, metilen biru klorida. Pewarna asam berikatan lebih kuat dengan komponen sitoplasma bakteri, terutama nukleus yang bersifat basa. Pewarna netral memiliki komponen asam dan basa yang saling meniadakan. Mereka adalah pewarna Romanowsky dan digunakan dalam pewarnaan bentuk parasit. Pewarna bisa alami (misalnya: karmine dan hematoksilin) atau derivatif batubara/anilin (misalnya: metilen biru, kristal violet). Pewarna supravital (sel yang diambil dari tubuh) dan intravital (sel masih bagian dari tubuh).

Apa itu metilen biru polikrom?

• Larutan metilen biru Loeffler yang diperlakukan dengan hidroksida kalium berubah menjadi metilen biru polikrom setelah penyimpanan yang lama dengan pengocokan. Digunakan dalam reaksi McFadyean untuk Bacillus anthracis di film darah dan demonstrasi granula metakromatik Corynebacterium diphtheriae.

Siapa yang menemukan pewarnaan Gram?

• Hans Christian Gram menemukan pewarnaan ini pada tahun 1884. Formulasi aslinya adalah Anilin Gentian violet, Lugol’s iodine, alkohol absolut, dan Bismark brown.

Apa saja teori-teori tentang pewarnaan Gram?

• Teori dinding sel: Dinding sel bakteri Gram positif 40 kali lebih tebal daripada sel Gram negatif, oleh karena itu mereka dianggap membantu mempertahankan kompleks pewarnaan-yodium.
• Teori Kandungan Lipid: Envelope sel bakteri Gram negatif mengandung membran tambahan (membran luar), sehingga mengandung lebih banyak lipid daripada bakteri Gram positif. Aceton atau alkohol melarutkan lipid sehingga membentuk pori besar pada bakteri Gram negatif yang melalui pori-pori itu kompleks pewarnaan-yodium bocor keluar. Alkohol/aceton mengeringkan bakteri Gram positif menyusutkan dinding sel dan menutup pori-porinya.
• Teori Ribonukleat Magnesium: Senyawa ribonukleat magnesium dan protein dasar yang terkonsentrasi di membran sel membantu bakteri Gram positif untuk menahan pewarna primer. Bakteri Gram negatif tidak memiliki zat ini.
• Teori pH Sitoplasma: Sitoplasma bakteri Gram positif dikatakan lebih asam (pH 2) daripada bakteri Gram negatif (pH 3). Oleh karena itu, pewarna diyakini berikatan dengan lebih afinitas dengan sel Gram positif.

Bagian bakteri mana yang sebenarnya diwarnai?

• Sitoplasma (terutama asam nukleat) yang diwarnai dan bukan dinding sel. Kehadiran dinding sel yang utuh penting untuk mempertahankan positivitas Gram.

Apa saja bakteri atau komponen bakteri yang tidak bisa diwarnai dengan pewarnaan Gram?

• Bakteri sangat ramping seperti Treponema.
• Sel yang mengandung zat lilin yang tidak dapat ditembus oleh pewarna seperti Mikobakteria.
• Bakteri intraseluler kecil seperti Chlamydia dan Rickettsia.
• Organel sel seperti kapsul, spora, flagela, dll.

Apa saja alternatif yang digunakan dalam pewarnaan Gram?

• Pewarna primer: Kristal violet, Methyl violet, dan Gentian violet.
• Mordan: Iodium Gram, jarang Iodium Lugol.
• Penghilang warna: Alkohol, aseton, campuran aseton-alkohol (1:1).
• Pewarna kontras: Karbol fuksin encer, safranin, merah netral (pewarna Sandiford untuk Gonokokus).

Apa saja kontrol positif dan negatif untuk pewarnaan Gram?

• Kontrol positif: Staphylococci.
• Kontrol negatif: E.coli, sel nanah.

Apa kondisi ketika bakteri Gram positif bisa tampak Gram negatif?

• Saat over-dekolonisasi oleh paparan yang panjang terhadap penghilang warna atau menggunakan aseton saja.
• Ketika dinding sel rusak oleh paparan lisozim atau antibiotik yang bertindak pada dinding sel seperti Penisilin.
• Kultur yang lama, di mana dinding sel melemah atau aksi enzim autolitik.
• Bakteri yang difagositosis, di mana dinding sel dijaj

ah oleh isi lisosomal.

Langkah mana yang lebih penting dalam pewarnaan Gram?

• Dekolorisasi adalah langkah paling penting karena langkah ini membedakan antara bakteri Gram positif dan Gram negatif. Over-dekolonisasi dapat mengakibatkan bakteri Gram positif tampak Gram negatif dan under-dekolonisasi dapat mengakibatkan bakteri Gram negatif tampak Gram positif.

Apa saja aplikasi dari pewarnaan Gram?

• Diagnosis duga cepat penyakit seperti meningitis bakterial.
• Pemilihan antibiotik empiris berdasarkan temuan pewarnaan Gram.
• Pemilihan media kultur yang sesuai berdasarkan temuan pewarnaan Gram.
• Penyaringan kualitas spesimen klinis, seperti dahak yang seharusnya mengandung banyak sel nanah dan sedikit sel epitel.
• Penghitungan bakteri.
• Penghargaan morfologi dan jenis bakteri dalam spesimen klinis.

Sebutkan jamur yang Gram positif?

• Candida sps.

Apa saja modifikasi pewarnaan Gram yang tersedia?

• Kopeloff dan Beerman’s (Pewarna primer: Methyl violet, penghilang warna: aseton atau campuran alkohol-asam asetat 1:1).
• Jensen’s (Pewarna primer: Methyl violet, penghilang warna: alkohol absolut, pewarna kontras: merah netral).
• Preston dan Morrell’s (Pewarna primer: kristal violet, penghilang warna: iodin-aseton).
• Weigert’s (Pewarna primer: Karbol gentian violet, penghilang warna: Anilin-xylol). Digunakan untuk mewarnai potongan jaringan.

Apa itu pewarnaan asam cepat?

• Pewarnaan asam cepat adalah pewarnaan di mana bakteri atau strukturnya memiliki kemampuan untuk menahan pewarna primer (karbol fuksin kuat) dan resisten terhadap penghilangan warna oleh asam mineral lemah seperti H2SO4, HCl. Bakteri atau struktur tersebut disebut tahan asam dan sifat ini disebut ketahanan asam. Ada dua jenis pewarnaan asam cepat, yaitu metode panas dan metode dingin. Metode panas (Ziehl-Neelsen) melibatkan pemanasan slide sementara metode dingin seperti metode Kinyoun dan Gabbett tidak melibatkan pemanasan slide.

Siapa yang memperkenalkan Pewarnaan asam cepat?

• Ehrlich pada tahun 1882 menemukan ketahanan asam. Metode aslinya melibatkan pewarnaan dengan gentian violet anilin dan penghilangan warna dengan asam nitrat pekat. Kemudian, metode ini diperbaiki oleh Ziehl dan Neelsen.

Mengapa Mikobakteria tahan asam?

• Dinding sel Mikobakteria terbuat dari zat lilin, asam mikolik, yang relatif tidak dapat ditembus oleh teknik pewarnaan biasa. Namun, dengan penerapan panas dan mordant (fenol), sel dapat diwarnai. Tujuan pemanasan adalah untuk melunakkan bahan lilin dari dinding sel dan memungkinkan pewarna masuk ke dalam sel. Fuksin basa lebih larut dalam fenol dan fenol adalah pelarut yang lebih baik untuk lipid dan lilin.

Apa saja komponen dari pewarnaan Ziehl-Neelsen?

• Pewarna primer: Karbol Fuchsin Kuat (mengandung fuksin dasar dan fenol).
• Penghilang warna: Asam sulfat 20%.
• Pewarna kontras: Metilen biru Loeffler atau 1% hijau Malakit, asam pikrat untuk pekerja buta warna.

Apa itu penghilang warna asam-alkohol?

• 3% HCl dalam alkohol 95% (spirit metilasi). Ini berguna dalam membedakan Mikobakteria saprofit dari Mikobakteria patogen. Mikobakteria patogen sama-sama tahan terhadap asam dan alkohol tetapi Mikobakteria saprofit hanya tahan terhadap asam. Alkohol 95% dapat digunakan sebagai penghilang warna sekunder setelah didekolonisasi dengan asam. Khusus digunakan dalam mewarnai sediaan yang disiapkan dari urin yang mungkin mengandung Mikobakteria smegmatis.

Apa saja variasi konsentrasi asam sulfat yang digunakan?

• Mycobacterium leprae - H2SO4 5%
• Oosist dari Cryptosporidium, Isospora - H2SO4 1%
• Potongan jaringan yang mengandung Actinomyctes, Nocardia - H2SO4 1%
• Kultur Nocardia - H2SO4 0,5%
• Spora bakteri - H2SO4 0,25-0,5%

Apa saja metode dingin dari pewarnaan asam cepat?

• Dua metode yaitu metode Kinyoun dan Gabbett tidak melibatkan pemanasan slide, sehingga disebut metode dingin. Pemanasan digantikan oleh peningkatan konsentrasi fenol dan memperpanjang durasi pewarnaan. Metode Kinyoun disukai untuk mendeteksi oosist Cryptosporidium dalam sampel tinja. Metode Gabbett memiliki penghilang warna dan pewarna kontras dalam satu larutan.

Mengapa slide harus dibanjiri dengan karbol fuksin kuat?

• Untuk distribusi panas yang merata, jika tidak slide dapat pecah.

Apa saja langkah pencegahan yang harus diambil saat mempersiapkan atau mengamati sediaan untuk AFB?

• Slide baru harus digunakan untuk setiap spesimen, karena goresan dapat memberikan hasil positif palsu.
• Sediaan yang merata dari bagian tebal dahak harus dibuat.
• Wadah pewarnaan tidak boleh digunakan untuk mewarnai sediaan karena ada risiko kontaminasi silang.
• Kertas blotting segar harus digunakan untuk setiap sediaan untuk mengeringkan slide dan mencegah transfer dari satu slide ke slide lain.

Bagaimana cara menafsirkan sediaan?

• Setidaknya 100 bidang pembesaran minyak harus dilihat sebelum menyatakan sediaan sebagai negatif.

  Sensitivitas sediaan rendah karena membutuhkan keberadaan 104 basil/ml untuk menjadi positif. Jika jumlah basil kurang dari ini, peluang mendeteksi mereka lebih rendah. Dalam kasus seperti itu, sampel harus menjalani teknik konsentrasi seperti metode Petroff. Jika sediaan positif untuk AFB, itu harus dihitung/digradasi. Kegagalan mendeteksi AFB tidak menyingkirkan tuberkulosis. Grading sediaan memiliki nilai prognostik.

Bagaimana sediaan diberi grading?

• Sediaan diberi grading tergantung pada jumlah basil yang terlihat.
• 3-9 basil/seluruh sediaan: +
• ≥10 basil/seluruh sediaan: ++
• ≥10 basil/dalam sebagian besar bidang pembesaran minyak: +++

Metode apa lagi yang tersedia untuk pewarnaan Mikobakteria?

• Sediaan dahak untuk Mikobakteria dapat diwarnai dengan zat fluoresen seperti Auramine dan Rhodamine karena memiliki afinitas terhadap asam mikolat di dinding sel mereka. Mikroskopi fluoresen berguna dalam penyaringan jumlah spesimen yang besar. Area besar dari sediaan dapat segera diamati di bawah objektif kering daya tinggi.

Apa itu tampilan berbentuk manik dari Mikobakteria?

• Tampilan berbentuk manik digunakan untuk menggambarkan penampilan Mikobakteria ketika sel tidak diwarnai secara merata, menunjukkan wilayah yang diwarnai dan tidak diwarnai. Bentuk ini umum pada Mycobacterium tuberculosis sementara Mycobacterium bovis mewarnai secara merata. Kebanyakan Mikobakteria saprofit mewarnai secara merata.

Apa itu granula metakromatik?

• Granula metakromatik adalah cadangan polimetaphosphate yang diproduksi oleh Corynebacterium diphtheriae dalam medium bergizi. Granula ini juga dikenal sebagai granula Babes Ernst, granula Volutin, tubuh polar, dll. Mereka disebut granula metakromatik karena mereka menunjukkan metakromasia, sifat di mana granula muncul dalam warna yang berbeda dari pewarna yang digunakan. Ketika diwarnai dengan metilen biru polikrom, mereka berwarna ungu. Mereka diproduksi dalam jumlah banyak dalam medium yang mengandung serum seperti kemiringan serum Loeffler.

Apa saja cara untuk mendemonstrasikan granula ini?

• Pewarnaan Albert, Neisser, Ponder, dan Pugh. Mereka dapat ditunjukkan sebagai tubuh refraktif dalam pengamatan basah atau struktur yang sedikit lebih gram positif dalam pewarnaan Gram.

Mengapa basil diatur pada sudut satu sama lain?

• Basil diatur pada sudut satu sama lain menyerupai huruf V atau L atau pola huruf Cina (cuneiform) karena sel anak tidak terpisah sepenuhnya setelah pembelahan sel (fisi biner).

Apa saja yang termasuk dalam larutan Albert A(1) dan B(2)?

• Larutan A(1) mengandung Toluidin biru, hijau Malakit, asam asetat glasial, dan alkohol sedangkan larutan B(2) mengandung iodin dan kalium iodida dalam air suling.