Prinsip dan Metode Analisis Fluoresensi Immunoassay (FIA)

Table of Contents

 

Foto : cliaanalyzer.com

INFOLABMED.COM - Fluorescence immunoassay (FIA) memiliki keunggulan berupa spesifisitas respon imun yang tinggi dan sensitivitas teknologi fluoresensi yang tinggi. (TRF) dkk. 

Pengukuran kualitatif atau kuantitatif dengan mikroskop fluoresensi, spektrofotometer fluoresensi mikroskopis, sitometer aliran, dan fluorometer dengan penyelesaian waktu banyak digunakan dalam diagnosis penyakit endokrin dan metabolik.

Prinsip dasar: teknologi immunoassay baru yang menggunakan antibodi atau antigen berlabel fluorescein sebagai pelacak, prinsipnya mirip dengan ELISA . 

Metode ini tidak hanya dapat mengukur antigen dan antibodi dalam cairan, tetapi juga mengidentifikasi antigen dan antibodi pada bagian jaringan secara kualitatif dan kuantitatif. 

Umumnya, karena autofluoresensi sampel dan reagen serta hamburan cahaya eksitasi, fluoresensi latar belakang tinggi, yang mempengaruhi sensitivitas pengujian. 

Lantanida umumnya digunakan sebagai penanda fluoresen (pelacak). Setelah pelacak digabungkan dengan antigen atau antibodi yang sesuai, fenomena fluoresensi diamati atau intensitas fluoresensi diukur dengan bantuan detektor fluoresensi, untuk menilai keberadaan, lokalisasi dan distribusi antigen atau antibodi atau mendeteksi kandungannya. antigen atau antibodi dalam sampel yang diuji.

Prinsip FIA sama dengan RIA, hanya saja labelnya diubah dari nuklida menjadi fluorescein. Fluorescein adalah zat yang dapat menghasilkan fluoresensi kuat di bawah penyinaran sinar laser.

 Setelah menyerap energi cahaya, ia menghasilkan molekul tereksitasi dalam waktu yang sangat singkat (10-8 hingga 10-9 detik) dan melepaskan panjang gelombang yang lebih tinggi dari cahaya eksitasi.

 Dengan cahaya tampak yang lebih panjang, zat dengan karakteristik ini terikat secara kimia pada molekul antibodi (atau antigen), dan setelah molekul antibodi (atau antigen) tersebut digabungkan dengan antigen (atau antibodi) yang cocok, fluoresensi diamati atau intensitas fluoresensi diukur dengan fluoresensi detektor, Menentukan keberadaan dan distribusi antigen (atau antibodi), atau mendeteksi kandungan antigen (atau antibodi) dalam sampel.

Immunoassay fluoresensi adalah metode yang menggabungkan spesifisitas reaksi imunologi dengan sensitivitas teknik fluoresen. 

Immunoassay fluoresensi memainkan peran penting dalam penelitian medis dasar dan diagnosis klinis, dan pengembangan probe berlabel dengan kinerja luar biasa merupakan faktor penentu dalam pengembangan teknologi ini. 

Dalam beberapa tahun terakhir, nanokristal fluoresen semikonduktor telah menarik perhatian luas karena sifat fisik dan kimianya yang khusus, dan telah banyak digunakan sebagai penanda fluoresen generasi baru di bidang optik, biologi, dan kedokteran.

Immunoassay fluoresensi dibagi menjadi empat jenis: metode langsung/metode tidak langsung/metode pelengkap/metode pelabelan ganda

1. Metode langsung: Antibodi fluoresen spesifik ditambahkan langsung ke spesimen tetap (mengandung antigen) untuk membentuk kompleks antigen-antibodi untuk mengidentifikasi antigen yang tidak diketahui.

 Dan berdasarkan distribusi dan morfologi fluoresensi, antigenisitasnya dapat ditentukan. 

Keuntungan metode ini adalah sederhana, cepat, dan spesifik; kerugiannya adalah antigen yang diketahui tidak dapat digunakan untuk mendeteksi antibodi yang tidak diketahui, dan deteksi setiap antigen memerlukan persiapan antibodi fluoresen spesifik yang sesuai, yang kurang sensitif. 

Biasa digunakan untuk pemeriksaan cepat bakteri dan virus.

2. Metode tidak langsung: juga dikenal sebagai metode antibodi ganda. Menggunakan antibodi berlabel fluoresen untuk mengidentifikasi antigen atau antibodi yang tidak diketahui, antibodi antiglobulin berlabel fluoresen dapat mendeteksi berbagai antigen atau antibodi yang tidak diketahui, dan sensitivitasnya 5 hingga 10 kali lebih tinggi daripada metode langsung. 

Kerugiannya adalah banyak komponen yang ikut serta dalam reaksi. Ini rumit dan memerlukan banyak perbandingan. Biasa digunakan dalam mendeteksi berbagai autoantibodi.

3. Metode komplemen: gunakan fluorescein untuk memberi label antibodi anti-komplemen untuk mengidentifikasi antigen atau antibodi yang tidak diketahui. 

Metode ini hanya memerlukan satu antibodi anti-komplemen berlabel. Karena komplemen berikatan dengan kompleks antigen-antibodi tanpa spesifisitas spesies, komplemen tidak dibatasi oleh antibodi yang diketahui atau spesies hewan dalam serum yang akan diuji, sehingga berbagai sistem antigen-antibodi dapat dideteksi. 

 Kerugiannya adalah mudah menghasilkan interferensi non spesifik, memerlukan kontrol lebih banyak, dan tidak mudah disimpan dalam waktu lama karena ketidakstabilan komplemen.

4. Metode pelabelan ganda: gunakan isothiocyanate kuning fluoresen (FITC) dan tetraethyl rhodamine (RB200) untuk memberi label antibodi yang berbeda untuk mendeteksi sampel matriks yang sama, jika terdapat dua antigen yang sesuai, maka Menampilkan warna fluoresensi yang berbeda.

Antibodi berlabel fluorescein

Fluoresensi yang ideal untuk memberi label antibodi harus memiliki karakteristik berikut:

1. Ia memiliki gugus kimia yang dapat membentuk ikatan kovalen dengan molekul protein, yang tidak mudah dipisahkan setelah pengikatan, dan fluorescein yang tidak terikat serta produk degradasinya mudah dihilangkan;

2. Dapat mempertahankan sifat biokimia yang melekat, aktivitas kekebalan dan spesifisitas antibodi setelah berikatan dengan antibodi; efisiensi fluoresensi (jumlah foton fluoresensi yang dipancarkan/jumlah foton cahaya yang diserap) tinggi, dan tidak ada penurunan yang signifikan setelah berikatan dengan protein;

3. Warna neon kontras dengan warna latar belakang pengamatan, sehingga mudah untuk dinilai;

4. Metode penggabungannya sederhana, cepat, aman dan tidak beracun;

5. Reagen sudah tersedia: Axispharm Fluorescent Dye.