Pewarnaan Gram

Table of Contents

 

Foto : biotechreality.com

INFOLABMED.COM - Pewarnaan Gram merupakan metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar (Gram positif dan Gram negatif) berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding selnya.

Nama metode ini diambil dari nama penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853-1938), yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 (Gram 1884). 

Pentingnya penentuan ini untuk identifikasi bakteri yang benar tidak dapat dilebih-lebihkan karena semua metode fenotipik dimulai dengan pengujian ini.

Metode Dasar Pewarnaan Gram

1. Pertama, satu lingkaran penuh kultur murni diolesi pada kaca objek dan dibiarkan kering. Kultur dapat berasal dari suspensi kental kultur cair atau koloni murni dari cawan yang tersuspensi dalam air pada kaca objek mikroskop. Pertimbangan penting:

• Ambil inokulum kecil—jangan lakukan pewarnaan tebal yang tidak dapat menghilangkan warna sepenuhnya. Hal ini dapat membuat organisme gram negatif tampak menjadi gram positif atau gram variabel.
• Ambil spesimen kultur baru— kultur lama ketika diwarnai akan menjadi tidak menentu.

2. Perbaiki sel pada slide dengan panas atau paparan metanol. Panaskan kaca objek dengan melewatkannya (sisi sel menghadap ke atas) melalui api untuk menghangatkan kaca. Jangan biarkan kaca menjadi panas saat disentuh.

3. Kristal violet (pewarna dasar) kemudian ditambahkan dengan menutupi sel-sel yang dipanaskan dengan larutan yang sudah disiapkan. Biarkan pewarna tersebut selama kurang lebih 1 menit.

4. Bilas sebentar slide dengan air. Sel-sel yang diberi panas akan terlihat ungu pada tahap ini.

5. Tambahkan larutan yodium (gram yodium) (1% yodium, 2% kalium iodida dalam air) selama 1 menit. Ini bertindak sebagai mordan dan memfiksasi pewarna, membuatnya lebih sulit untuk menghilangkan warna dan mengurangi beberapa variabilitas tes.

6. Bilas sebentar dengan air.

7. Hilangkan warna sampel dengan menggunakan etanol 95% atau campuran aseton dan alkohol. Hal ini dapat dilakukan dengan mengalirinya secara stabil, atau serangkaian pencucian.

 Aspek yang penting adalah memastikan bahwa semua warna yang keluar dapat dilakukan dengan mudah. 

Langkah ini untuk menghilangkan kristal violet yang tidak terikat, meninggalkan organisme Gram-positif berwarna ungu, sedangkan organisme Gram-negatif tidak berwarna.

 Dekolorisasi sel adalah langkah proses yang paling “bergantung pada operator” dan kemungkinan besar dilakukan secara tidak benar.

8. Bilas dengan air untuk menghentikan dekolorisasi.

9. Bilas kaca objek dengan counterstain (safranin atau karbol fuchsin) yang akan mewarnai seluruh sel menjadi merah. 

Counterstain mewarnai sel gram negatif dan gram positif. Namun warna ungu gram positif tidak berubah dengan adanya counter-stain, efeknya hanya terlihat pada sel gram negatif yang sebelumnya tidak berwarna, kini tampak merah jambu/merah.

10. Tepuk-tepuk perlahan dan biarkan slide mengering. 

Apa yang terjadi Selama Proses Pewarnaan Gram Tersebut?

Bakteri memiliki dinding sel yang terbuat dari peptidoglikan. Dinding sel ini memberikan kekakuan pada sel, dan perlindungan dari lisis osmotik dalam larutan encer. 

Bakteri gram positif memiliki dinding sel seperti jaring yang tebal, bakteri gram negatif memiliki dinding sel yang tipis dan membran bilayer fosfolipid luar.

Warna kristal violet cukup kecil untuk menembus matriks dinding sel kedua jenis sel, namun kompleks pewarna yodium hanya keluar dengan susah payah (Davies et al. 1983)

Campuran penghilang warna tersebut mengeringkan dinding sel, dan berfungsi sebagai pelarut untuk membilas kompleks pewarna-yodium. 

Pada bakteri Gram-negatif, ia juga melarutkan membran luar dinding sel Gram-negatif sehingga membantu pelepasan pewarna.

 Ketebalan dinding sellah yang menjadi ciri respon sel terhadap prosedur pewarnaan. Selain gram positif dan gram negatif, ada banyak spesies yang “variabel gram” dengan struktur dinding sel perantara (Beveridge dan Graham 1991). 

Seperti disebutkan di atas, langkah dekolorisasi sangat penting untuk keberhasilan prosedur.

Metode Gram melibatkan pewarnaan sel sampel dengan warna biru tua, menghilangkan warna sel-sel tersebut dengan dinding sel yang tipis dengan membilas sampel, kemudian melakukan pewarnaan ulang dengan pewarna merah.

 Sel bakteri dengan dinding sel yang tebal tampak berwarna biru (gram positif) karena kristal violet tertahan di dalam sel, sehingga pewarna merah tidak terlihat. 

Sel-sel yang dinding selnya tipis, sehingga mengalami dekolorisasi, tampak berwarna merah (gram negatif).

Merupakan praktik yang bijaksana untuk selalu menyertakan kontrol positif dan negatif pada prosedur pewarnaan untuk memastikan keakuratan hasil (Murray et al 1994) dan untuk melakukan uji kemahiran terhadap kemampuan teknisi dalam menafsirkan noda dengan benar (Andserson, et al.2005).

Bagaimana Akibat Dekolorisasi berlebihan?

Jelas bahwa langkah dekolorisasi adalah langkah yang paling mungkin menyebabkan masalah pada pewarnaan gram. 

Kekhawatiran khusus dalam langkah dekolorisasi secara berlebihan ini dapat dijelaskan sebagai berikut (McClelland 2001) :

• Panas berlebihan selama fiksasi: Panas yang mengikat sel, jika dilakukan secara berlebihan, akan mengubah morfologi sel dan membuat sel lebih mudah terdekolorisasi.
• Konsentrasi kristal violet yang rendah: Konsentrasi kristal violet hingga 2% dapat digunakan dengan sukses, namun konsentrasi yang rendah menyebabkan sel-sel yang ternoda mudah terdekolorisasi. Larutan standar 0,3% baik, jika penghilangan warna umumnya tidak melebihi 10 detik.
• Pencucian berlebihan di antara tahap-tahap: Warna kristal violet mudah terhapus dengan air (tetapi tidak dengan kompleks kristal violet-iodin). Jangan gunakan bilas air lebih dari 5 detik pada setiap tahap prosedur.
• Paparan yodium yang tidak mencukupi: Jumlah mordan yang tersedia penting untuk pembentukan kompleks kristal violet – yodium. Semakin rendah konsentrasinya, semakin mudah untuk menghilangkan warna (umumnya digunakan 0,33% – 1%). Selain itu, QC reagen juga penting karena paparan udara dan suhu tinggi mempercepat hilangnya yodium Gram dari larutan. Botol tertutup (konsentrasi awal 0,33%) pada suhu kamar akan kehilangan >50% yodium yang tersedia dalam 30 hari, botol terbuka >90%. Hilangnya 60% yodium menghasilkan hasil yang tidak menentu.
• Dekolorisasi berkepanjangan: etanol 95% mengalami dekolorisasi lebih lambat, dan mungkin direkomendasikan untuk teknisi yang tidak berpengalaman, sedangkan pekerja berpengalaman dapat menggunakan campuran aseton-alkohol. Keterampilan diperlukan untuk mengukur kapan dekolorisasi selesai.
• Pewarnaan balik (counterstaining) yang berlebihan: Karena pewarnaan balik (counterstain) juga merupakan pewarna basa, kompleks kristal violet—iodin dalam sel gram positif dapat digantikan dengan pewarnaan balik (counterstain) yang berlebihan. Counterstain tidak boleh dibiarkan pada slide lebih dari 30 detik.