Isolasi dan Purifikasi DNA Dari Sampel Rambut

Table of Contents

 

Foto : letstalkscience.ca

INFOLABMED.COM - DNA atau deoxyribonucleid acid adalah material genetik yang tersusun atas tiga komponen. 

Komponen-komponen tersebut adalah molekul gula pentose (deoxyribosa), gugus phosphate, dan basa nitrogen. 

Pada organisme tingkat tinggi (manusia, hewan, dan tumbuhan) DNA dapat kita temukandalam inti sel (DNA inti), mitokondria (DNA mitokondria), dan di dalam kloroplas (DNA kloroplas). 

DNA yang ditemukan di dalam inti disebut juga DNA kromosomal sedangkan yang ditemukan di luar inti disebut DNA ekstrakromosomal.

DNA dari berbagai sumber di atas secara in vitro dapat diisolasi dan dipurifikasi dengan teknik-teknik tertentu dan ini merupakan tahap pertama dari berbagai teknologi untuk menganalisis DNA.

 Pemilihan teknik mengisolasi dan memurnikan DNA yang tepat akan menghasilkan DNA dalam keadaan murni (pure) yaitu DNA yang terbebas dari komponen-komponen sel lainnya seperti RNA, protein, karbohidrat, dan lain-lain.

Tujuan Isolasi dan Purifikasi DNA Dari Sampel Rambut

1. Untuk mengetahui dan memahami teknik isolasi DNA dari sampel rambut.
2. Untuk mengetahui dan memahami teknik purifikasi DNA dari sampel rambut.
3. Untuk membandingkan hasil isolasi DNA dengan cara 1 dan dengan cara 2.

Alat dan Bahan Isolasi dan Purifikasi DNA Dari Sampel Rambut

1. 10-20 folikel rambut yang bersih

2. Larutan A (200mM NaOH):

     - 1M NaOH = 2 ml

      - MilliQ = 8 ml

3. Larutan B (200mM HCl, 100mM Tris HCl, pH 8,5):

     - 1 M Tris HCl pH 8,5 = 1 ml

     - Concentrated HCl = 167 µl

     - MilliQ = 8,843 ml

4. Buffer H

      - 1x buffer PCR (ambil 10 ml)

      -  Proteinase K, dengan konsentrasi 100 µg/ml (ambil 1 ml proteinase 10 mg/ml)

      - Tween 20 0,5% (ambil 0,5 ml)

      - Tambahkan MilliQ hingga volume mencapai 100 ml dan simpan di freezer (suhu -20oC).

5. 3M Sodium Acetat (pH 4,8-5,2)

6. Etanol Absolut

7. Larutan TE

Cara Kerja Isolasi dan Purifikasi DNA Dari Sampel Rambut

Cara 1

- Potong 10-20 folikel rambut 3-5mm dengan menggunakan gunting steril dan masukkan ke dalam eppendorf 1,5ml.

- Tambahkan 50 µl larutan A ke dalam tabung eppendorf.

- Sentrifugasi sebentar agar folikel mengumpul di dalam larutan A.

- Panaskan pada suhu 95-100oC selama 15 menit.

- Sentrifugasi sebentar agar larutan yang menguap dan menempel di dinding atau tutup eppendorf turun ke bawah.

- Tambahkan 50 µl larutan B.

- Vortex dan sentrifugasi selama 2 menit dengan kecepatan maksimal 13.000 rpm.

- Pindahkan 90 µl larutan bagian atas ke tabung eppendorf yang baru, sisa kotoran berada di bagian bawah dibuang.

- Simpan pada suhu -20oC. 

Cara 2

- Potong 10-20 folikel rambut 3-5mm dengan menggunakan gunting steril dan masukkan ke dalam eppendorf 1,5ml.

- Tambahkan 50 µl buffer H ke dalam tabung eppendorf.

- Sentrifugasi sebentar agar folikel mengumpul di dalam buffer H.

- Inkubasi pada suhu 60oC selama 30 menit.

- Inkubasi pada suhu 95-100oC selama 10 menit agar proteinase K inaktif.

- Sentrifugasi sebentar agar larutan yang menguap dan menempel di dinding atau tutup eppendorf turun ke bawah.

- Simpan pada suhu -20oC.

Purifikasi Sampel Rambut

- Ambil 25 µl larutan DNA hasil isolasi.

- Tambahkan 2,5 µl 3 M sodium asetat (pH 4,8-5,2) dan 250 µl etanol absolute yang telah disimpan di dalam lemari pendingin (-4 oC), kemudian dikocok perlahan-lahan dengan tangan.

- Inkubasi di dalam freezer -20oC selama 60 menit.

- Sentrifugasi pada 13.000 rpm selama 10 menit

- Buang supernatant.

- Keringkan pellet dengan bantuan aspirator.

- Tambahkan 12,5 µl larutan TE atau air milliQ dan simpan sampel DNA pada temperature 4oC.

Sumber : Kholifah Holil, M.Si. (2014). Buku Petunjuk Praktikum Teknik Analisis Biologi Molekuler.Fakultas Sains dan Teknologi; UIN Maulana Malik Ibrahim Malang