Pewarnaan Negatif- Prinsip, Reagen, Prosedur, dan Hasil Pemeriksaan

Table of Contents

 

Negative Stain Preparation Showing Cocci In Clusters. (Source : laboratoryhub)

INFOLABMED.COM - Pewarnaan negatif adalah teknik penting dalam studi bentuk morfologis, ukuran, dan susunan sel bakteri yang sulit diwarnai. 

Metode ini sangat berguna untuk mengamati organisme seperti Spirilla yang sulit diwarnai, serta sel-sel yang terlalu rapuh untuk difiksasi panas. 

Selain itu, teknik ini digunakan untuk persiapan sampel biologis dalam mikroskopi elektron. 

Hal ini memungkinkan pengamatan virus, bakteri, flagela bakteri, struktur membran biologis, dan protein atau agregat protein dengan daya hambur elektron rendah.

Prinsip Pewarnaan Negatif

Pewarnaan negatif membutuhkan pewarna asam seperti Tinta India atau Nigrosin. Pewarna asam bersifat memberikan ion hidrogen (proton), sehingga kromofor pewarna menjadi bermuatan negatif. 

Karena permukaan sebagian besar sel bakteri bermuatan negatif, permukaan sel akan menolak pewarna. 

Hasilnya, sel bakteri akan terlihat sebagai bercak yang jelas pada latar belakang gelap.

Reagen Pewarnaan Negatif

1. Tinta India
2. Nigrosin: Nigrosin 100 gm/L, Formalin 5 ml/L dalam air

Prosedur Pewarnaan Negatif

1. Teteskan sejumlah kecil nigrosin pada ujung slide yang sudah dibersihkan dan dinyalakan api.
2. Ambil sejumlah kecil kultur dari slant dengan lingkaran inokulasi dan sebarkan di titik pewarna tanpa menyebarkan tetesan tersebut.
3. Gunakan slide bersih lainnya untuk menyebarkan tetesan pewarna yang mengandung organisme dengan teknik berikut.
4. Letakkan satu ujung slide bersih pada tengah slide dengan pewarna. Miringkan slide bersih ke arah tetesan hingga membentuk sudut tajam dan tarik slide tersebut menuju tetesan hingga menyentuh tetesan dan menyebabkan pewarna menyebar sepanjang tepi slide. Dengan menjaga sudut tajam kecil antara slide, dorong slide penyebarnya ke ujung bersih slide yang diwarnai, menarik tetesan di belakang slide penyebarnya dan menghasilkan smear yang lebar, rata, dan tipis.
5. Biarkan smear mengering tanpa pemanasan.
6. Fokuskan area tipis di bawah perendaman minyak dan amati sel yang tidak diwarnai dikelilingi oleh pewarna abu-abu.

Prosedur untuk Melihat dengan Mikroskop Elektron Transmisi (TEM)

1. Pegang kisi berlapis film ke atas dengan tang klem penjepit sendiri.
2. Buat campuran 1:1 dari sampel dan pewarna negatif (contoh: 2% uranyl acetate atau 2% natrium atau kalium fosfotungstat, pH 7,4). Tambahkan 5µl ke kisi.
3. Inkubasi selama 30-90 detik, kemudian hilangkan cairan berlebih dengan tepi robek kertas saring. Keringkan udara dan periksa di bawah TEM.

Hasil Pewarnaan Negatif

Sel-sel yang tidak diwarnai dikelilingi oleh pewarna abu-abu.

Referensi

1. YashRoy R C (1990) Lamellar dispersion and phase separation of chloroplast membrane lipids by negative staining electron microscopy. Journal of Biosciences, vol. 15 (2), pp 93-98.